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研究背景：深静脉血栓形成是骨科临床常见并发症之一，好发于下肢骨折患者，如血栓脱落可引起致命性肺栓塞，晚期常遗留静脉炎综合征，严重影响患者的康复及生命安全。新近有研究表明富亮氨酸重复序列相互作用蛋白1（LRRFIP1）可能与血栓的形成有重要联系。LRRFIP1基因及其编码的蛋白质，通过与血小板细胞膜上表达的相关蛋白相互作用，血小板细胞骨架的结构进而发生改变，影响血小板的凝血功能并导致血栓的形成。因此我们拟通过RNA干扰技术靶向沉默LRRFIP1基因，并建立动物模型，观察LRRFIP1基因对深静脉血栓形成的影响，探讨LRRFIP1基因沉默对预防骨科深静脉血栓形成的效果，为最终应用于在体基因治疗深静脉血栓提供相关实验依据。研究方法：1、LRRFIP1基因RNAi慢病毒载体的构建设计并合成LRRFIP1基因靶向的双链DNA：根据GenBank报道的小鼠LRRFIP1基因序列，通过将Ambion公司的设计软件与RNA干扰序列的设计原则相结合，设计出3对针对LRRFIP1基因shRNA的寡核苷酸序列，分别构建质粒，转染293T细胞，RT-PCR和western blot测定沉默效率，使用沉默效率最高的质粒构建LRRFIP1基因RNAi的慢病毒载体。2、小鼠骨髓细胞原代分离与培养将1周龄的新生小鼠消毒后处死，分离骨髓细胞，接种于无菌培养瓶，置37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。选取生长良好的第三代细胞进行后续实验。3、小鼠骨髓细胞慢病毒感染在24孔培养板接种若干孔，将35X104个目的细胞接种至每个孔内，50%左右细胞的贴壁率应在铺板时达到，每孔培养基体积为100μl；70%左右的细胞贴壁率应在进行病毒感染时达到。感染96小时后，在荧光倒置显微镜下观察荧光，估计慢病毒感染目的细胞的效率。4、动物分组与给药将健康成年雄性ICR小鼠（20±2g）随机分为：1)正常对照组（control）；2)假手术组（sham）：不给药；3)低分子肝素（LMWH）治疗组（LMWH）：术前通过尾静脉注射LMWH一次(2000U·kg-1)，术后每日注射一次LMWH (2000U·kg-1·d-1)；4)模型组（model）：术前、术后每日注射等体积生理盐水；5) LRRFIP1shRNA治疗组（shRNA）：术前注射LRRFIP1shRNA慢病毒感染的小鼠BMCs （1×107cells/mouse）；6)阴性shRNA治疗组（Negative shRNA）：术前注射LRRFIP1阴性对照shRNA慢病毒感染的小鼠BMCs （1×107cells/mouse）；采用下腔静脉结扎法制作小鼠深静脉模型。分别于术后第1、3、7天每组处死6只小鼠。称量血栓重量；酶联免疫吸附法（ELISA）检测小鼠血清p选择素及D二聚体水平，Western blot检测血栓中LRRFIP1蛋白的表达。5、统计分析计量资料表示为means±S.D。采用SPSS17.0for Windows进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用Fisher LSD分析。以p<0.05作为有统计学差异。结果：1.成功构建了携LRRFIP1shRNA的慢病毒载体，LRRFIP1shRNA转染后LRRFIP1基因及蛋白表达均显著降低；2. LRRFIP1shRNA显著抑制血栓中LRRFIP1蛋白表达。在模型组中，在术后第1、3、7天血栓中LRRFIP1蛋白的表达显著降低（P<0.01）。在所观察的3个时间点上，使用LRRFIP1shRNA处理可以进一步抑制LRRFIP1在血栓中的表达，提示LRRFIP1shRNA慢病毒在体内可以有效抑制LRRFIP1的表达。但低分子肝素和阴性shRNA对LRRFIP1表达无影响。3. LRRFIP1shRNA显著抑制小鼠下肢静脉血栓形成。LRRFIP1shRNA抑制体内血栓形成明显的。在术后第7天，模型组小鼠血栓重量为8.63±0.40mg，在LRRFIP1shRNA治疗组，血栓重量降低到2.15±0.57mg （P<0.01）。血栓形成抑制率为75.10%。而在低分子肝素治疗组和阴性shRNA治疗组，血栓重量分别为2.20±0.33mg和6.47±0.66mg，血栓形成抑制率分别为74.50%and25.02%。4. LRRFIP1shRNA能够降低小鼠血清p-选择素和d-二聚体水平。与正常对照组和假手术组相比，模型组血浆P-选择素水平明显增加（P<0.01）。LRRFIP1shRNA治疗显着降低血浆P-选择素水平（P<0.01）。血浆D-二聚体水平在模型组也明显升高（P<0.01），而LRRFIP1shRNA治疗可显著地抑制D-二聚体水平的上调（P<0.01）。然而，低分子肝素和阴性shRNA对血浆P-选择素、D-二聚体水平的影响不大。结论：1.成功构建了LRRFIP1shRNA表达质粒及慢病毒载体；2. LRRFIP1shRNA在体内、外均能够抑制LRRFIP1mRNA和蛋白表达；3. LRRFIP1基因干扰能抑制小鼠下肢深静脉血栓形成；4. LRRFIP1shRNA抑制深静脉血栓形成与其降低血浆p-选择素和d-二聚体水平有关。