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杂色鲍(Haliotis diversicolor)是我国南方水产养殖的重要养殖种类。附着变态是杂色鲍早期发育过程的关键时期,幼虫敏感而脆弱,其变态成功与否将影响到种群分布和数量变动。因此研究杂色鲍幼虫附着变态相关的功能基因对于深入揭示幼虫附着变态分子机制具有重要理论意义,并为生产实践提供指导。 本文从实验室构建的杂色鲍转录组数据库中,克隆获得了与GABA相关的四个基因的序列片段:glutamic acid decarboxylase、GABAA Receptorζ subunit、GABAB Receptorα1 subunit and GABAA Receptorρ subunit,分别命名为HdGAD、HdGABAA-ζ、HdGABAB-α1、HdGABAA-ρ,并对这4个基因在杂色鲍幼虫附着变态过程中的作用进行研究,主要结果如下: 1)杂色鲍HdGAD基因的cDNA序列全长2331bp,开放阅读框(ORF)长1710bp,编码569个氨基酸,预测蛋白含有一个特殊的DOPA_ deC_ like功能域,一个GadA功能域,有一个CSdA多功能域,属于Pyridoxalphosphate-dependent decarboxylase(IPR002129)家族。HdGAD基因组DNA全长为4908bp,包含4个外显子和3个内含子。Real-time PCR结果显示,HdGAD在杂色鲍早期胚胎发育各个时期均有表达,自面盘幼体中期,其表达水平急剧上升,且在匍匐幼体早期和匍匐幼体中期维持较高的表达水平。RNAi技术沉默HdGAD发现,下调后的HdGAD对杂色鲍幼虫的附着变态影响效果不明显(P>0.05),而且不会影响杂色鲍幼虫的生存(P>0.05)。 2)杂色鲍HdGABAA-ζ基因的5‘端序列长1362bp,部分开放阅读框(ORF)长1069bp,可编码356个氨基酸,含有1个Neurchan_lig-bd结构域,1个神经递质配体门控离子通道跨膜结构域,属于gama-aminobutric acid Areceptor/Glycine receptor alpha家族。Real-time PCR结果显示,HdGABAA-ζ基因在杂色鲍胚胎发育的各时期表达量有着明显不同:从卵、受精卵到桑葚胚之前的时期,HdGABAA-ζ基因的表达水平很低,且在受精卵和多细胞时期检测不到信号(Ct>=35);而从面盘时期开始到匍匐中期,HdGABAA-ζ的表达量维持较高水平。RNAi技术沉默HdGABAA-ζ来研究其对杂色鲍附着变态中的作用发现,下调后的HdGABAA-ζ能明显使杂色鲍幼虫的附着率降低(P<0.05),死亡率升高(P<0.05)。 3)杂色鲍HdGABAB-α1基因的5端序列长1890bp,部分开放阅读框(ORF)长1861bp,可编码620个氨基酸,含有1个PBP1_GABA_b_receptor结构域,一个7tm3结构域,一个LivK结构域,一个ANFreceptor结构域,属于Periplasmic_binding_protein_Type_1和7tm3超家族。Real-time PCR结果显示,HdGABAB-α1基因在杂色鲍胚胎发育的各时期都有较高水平的表达,随着各时期的变化而有所不同,且在匍匐早期表达水平最高,是卵子表达量的34.6倍。RNAi技术沉默HdGABAB-α1来研究其对杂色鲍附着变态中的作用发现,沉默后的HdGABAB-α1对杂色鲍幼虫的附着变态和生存无明显影响(P>0.05)。 4)杂色鲍HdGABAA-ρ基因的cDNA序列全长2338bp,开放阅读框(ORF)长1038bp,可编码345个氨基酸,含有一个神经递质门控通道结构域,一个神经递质门控离子通道跨膜结构域,一个神经递质门控离子通道配体结合域,属于Neurotransmitter-gated ion-channel(IPR006201)家族。Real-time PCR结果显示,HdGABAA-ρ基因在杂色鲍胚胎发育的早期表达水平很低,表达信号很弱(Ct>=35),而HdGABAA-ρ从匍匐早期开始明显地表达,其后的匍匐中期也维持较高水平的表达量。RNAi技术沉默HdGABAA-ρ来研究其对杂色鲍附着变态中的作用发现,下调后的HdGABAA-ρ能极明显降低杂色鲍幼虫的附着率(P<0.01),使死亡率升高(P<0.05)。 5) GABA受体特异性激动剂的药理学实验发现,在一定浓度范围(0.01-10μmol.L-1)内,蝇荨醇(Muscimol)作为GABAA受体的特异性激动剂能明显的促进杂色鲍幼虫附着,而对杂色鲍幼虫的生存不会产生影响,除了0.10μmol.L-1蝇荨醇外(P<0.05);氯苯氨丁酸(Bacofen)作为GABAB受体的特异性激动剂,在一定范围内能促进杂色鲍幼虫的附着,但高于10μmol.L-1,就会影响其生存(P<0.01)。