氟致胆碱能神经递质传递受阻与学习记忆能力下降有关,但其作用机制尚未完全阐明。在胆碱能系统中,高亲和力胆碱转运体1（choline transporter 1,Cht1）是转运胆碱合成乙酰胆碱（acetycholine,ACh）的主要限速因子,其异常表达所引起的ACh合成、释放障碍与认知缺陷密切相关。近年来研究发现,长链非编码RNA（long-non coding RNA,lncRNA）除了直接参与基因的表达调控外,也可作为一种竞争性内源核糖核酸（competing endogenous ribonucleic acid,ceRNA）与微小RNA（micro RNA,miRNA）发生相互作用,从而参与靶基因的表达调控,在外源性物质所致神经毒性中起着重要作用。第一部分LncRNA LOC680225/miR-194-5p/Slc5a7在氟神经毒性中的作用目的:通过建立氟染毒Sprague-Dewley（SD）大鼠模型和氟染毒加干预的PC12细胞模型,探讨lncRNA LOC680225/miR-194-5p/Slc5a7调控网络介导的胆碱能系统失调在氟神经毒性中的作用。方法:体内实验:40只SPF级雌性SD大鼠（8周龄）随机分为对照组和10、50、100 mg/L的NaF染毒组,每组10只。经自由饮水染毒6个月后,釆用Morris水迷宫系统检测大鼠学习记忆能力;采用尼氏染色法观察大鼠海马神经元的变化;提取大鼠海马组织（对照组和100 mg/L NaF染毒组）RNA进行全转录组测序（mRNA、lncRNA和miRNA）。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集分析差异基因介导的信号通路,筛选出目标基因;通过生物信息学分析筛出与目标基因具有互作调控的目标lncRNA;根据ceRNA调控机制,软件预测目标lncRNA与目标基因之间共同结合的miRNA。使用实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）验证大鼠海马组织中目标基因、目标lncRNA和目标miRNA的表达,以及胆碱乙酰转移酶（choline acetyltransferase,ChAT）、乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase,AChE）、M1毒蕈碱型乙酰胆碱受体（M1muscarinic acetylcholine receptor,M1mAChR）、M3毒蕈碱型乙酰胆碱受体（M3muscarinic acetylcholine receptor,M3mAChR）和α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7nicotinic acetylcholine receptor,α7nAChR）的mRNA表达情况。采用western blot技术检测Cht1、ChAT、和AChE的蛋白表达水平,酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测大鼠血清中乙酰胆碱（acetycholine,ACh）的含量。体外实验:将大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞PC12细胞分为对照组和20、40及80mg/L NaF染毒组,染毒处理24 h后,采用扫描电子显微镜观察（scanning electron microscope,SEM）氟对PC12细胞神经突触连接的影响,釆用ELISA检测细胞上清中ACh的含量,qRT-PCR检测目标基因、目标lncRNA、目标miRNA、ChAT、AChE、突触后致密蛋白-95（post synaptic density protein-95,PSD-95）、突触蛋白-1（synapsin-1）、M1mAChR、M3mAChR和α7nAChR的mRNA表达情况,采用western blot技术检测Cht1、ChAT、AChE、PSD-95、synapsin-1和cleaved caspase 3的蛋白表达水平。采用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）技术检测Cht1、目标lncRNA和miRNA在PC12细胞中的定位和表达水平。利用目标miRNA mimic和inhibitor以及目标lncRNA过表达腺病毒转染PC12细胞,检测Cht1和cleaved caspase 3的蛋白表达水平以及细胞存活率。采用双荧光素酶报告基因实验验证目标miRNA与目标lncRNA以及Slc5a7的结合情况。结果:体内实验:水迷宫实验结果显示,与对照组相比,NaF染毒组大鼠穿越平台的次数、在目标象限停留的时间占总时间的比值均降低（P＜0.05）。尼氏染色结果显示,对照组大鼠海马神经元排列紧密,胞质中尼氏小体数量丰富,随着NaF染毒剂量的增加,逐渐出现神经元排列疏松,尼氏小体颜色变浅,数量减少。转录组测序结果显示,氟暴露致大鼠海马组织表达上调的mRNA有7条,下调的有37条;KEGG通路富集分析结果显示,差异基因涉及的信号通路中胆碱能突触与神经毒性有关。表达下调的溶质载体家族5成员7（solute carrier family 5 member 7,Slc5a7）基因编码Cht1。氟暴露致大鼠海马组织表达上调的lncRNA有3条,下调的有13条;LOC680225与Slc5a7存在互作调控。氟暴露致大鼠海马组织表达上调的miRNA有42条,下调的有9条。LOC680225与Slc5a7之间共同结合的miRNA有rno-miR-194-5p和rno-miR-511-3p;miR-194-5p在人和大鼠中序列相同,因此筛选出miR-194-5p开展进一步研究。qRT-PCR结果显示,随着NaF染毒剂量的增加,LOC680225、Slc5a7、ChAT、M1mAChR、M3mAChR和α7nAChR的mRNA表达水平降低,miR-194-5p和AChE的mRNA表达水平升高（P＜0.05）。Western blot结果显示,随着NaF染毒剂量的增加,Cht1和ChAT蛋白表达水平降低,AChE蛋白表达水平升高（P＜0.05）。ELISA结果显示,随着NaF染毒剂量的增加,大鼠血清中ACh的含量降低（P＜0.01）。体外实验:SEM观察发现,随着NaF染毒剂量的增加,PC12细胞突起发生断裂,突触连接减少,细胞发生皱缩,ACh的含量随NaF染毒剂量的增加而降低（P＜0.05）。qRT-PCR结果显示,与对照组相比,NaF染毒组PC12细胞中LOC680225、Slc5a7、ChAT、M1mAChR、M3mAChR和α7nAChR的mRNA表达水平降低,miR-194-5p和AChE的mRNA表达升高（P＜0.05）。Western blot结果显示,随着NaF染毒剂量的增加,Cht1、ChAT的蛋白表达水平降低,AChE以及cleaved caspase3蛋白表达水平升高（P＜0.05）。此外,随着NaF染毒剂量的增加,PSD-95和synapsin-1的蛋白和mRNA表达水平均降低（P＜0.05）。FISH结果显示,Cht1和LOC680225在胞浆和胞核中都有分布,但主要分布在胞浆中,miR-194-5p在胞浆和胞核中均匀分布。与对照组相比,miR-194-5p mimic组miR-194-5p的表达明显升高,Cht1的表达明显降低（P＜0.05）;miR-194-5p inhibitor组miR-194-5p的表达明显降低,Cht1的表达明显升高（P＜0.05）;Ad-LOC680225组LOC680225和Cht1的表达均升高（P＜0.05）。与单纯NaF染毒组相比,miR-194-5p mimic+NaF组Cht1的表达降低,cleaved caspase3的表达升高,细胞存活率下降（P＜0.05）;miR-194-5p inhibitor+NaF组Cht1的表达升高,cleaved caspase3的表达降低,细胞存活率升高（P＜0.05）;Ad-LOC680225+NaF组Cht1的表达升高,cleaved caspase3的表达降低,细胞存活率升高（P＜0.05）。双荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-194-5p可与LOC680225以及Slc5a7靶向结合。结论:氟暴露可引起SD大鼠海马组织和PC12细胞中LOC680225表达降低、miR-194-5p表达升高、Slc5a7表达降低进而导致胆碱能系统失调,最终引起神经毒性。LOC680225可作为ceRNA通过与miR-194-5p竞争性结合进而共同调控Slc5a7的表达,介导了胆碱能系统失调在氟神经毒性中的作用。第二部分低中度氟暴露、胆碱能系统与儿童智力的关联分析通过第一部分的研究,我们发现,胆碱能系统参与了氟神经毒性的发生发展,且lncRNA LOC680225和miR-194-5p参与其中。大量的流行病学研究表明,高氟暴露区儿童的智商（Intelligence Quotients,IQ）明显低于相应的低氟区,但是氟致儿童IQ降低的机制目前尚未阐明。目的:本研究通过横断面研究,探讨低中度氟暴露、胆碱能系统与儿童IQ的关系。方法:采用多阶段随机抽样的方法在天津市宝坻区高氟区（水氟浓度＞1.0mg/L）和对照区（水氟浓度≤1.0 mg/L）各抽取329名和380名7～13岁学龄儿童作为调查对象。收集儿童晨尿和外周血等生物样本,采用氟离子选择电极法测定饮用水和尿液中氟离子的含量。采用联合型瑞文测验对儿童的IQ进行检测,ELISA检测血清中ChAT、Cht1、AChE和ACh的表达水平。采用多元线性回归、logistic回归模型评估低中度氟暴露、胆碱能系统和IQ之间的关系,并通过中介效应模型,探讨胆碱能系统在氟暴露与儿童IQ关联中的作用。结果:多元线性回归分析结果显示,水氟浓度与儿童血清中ChAT、Cht1、ACh浓度呈负相关,与AChE浓度呈正相关,且水氟浓度升高与血清ChAT、Cht1、ACh浓度降低、AChE浓度升高均存在剂量反应关系（P for trend分别为0.008、＜0.001、＜0.001、0.017）。尿氟浓度与儿童血清ChAT、Cht1呈负相关,与AChE浓度呈现正相关,尿氟浓度升高与血清ChAT、Cht1浓度降低、AChE浓度升高均存在剂量反应关系（P for trend分别为0.013、＜0.001、0.013）。水氟、尿氟浓度与儿童IQ得分均呈现负相关。Logistic回归分析结果显示,水氟浓度每增加1 mg/L,儿童拥有中下智商的概率增加了43%（OR=1.43,95%CI:1.08,1.88）,拥有超常IQ的概率降低了49%（95%CI:0.12,0.70）;尿氟浓度每增加1 mg/L,儿童拥有超常IQ的概率降低了66%（95%CI:0.15,0.86）。多元线性回归结果显示,AChE浓度与儿童IQ得分呈现负相关。Logistic回归分析结果显示,与AChE浓度位于对照组（≤133.66 nmol/L）的儿童相比,AChE浓度位于第四分位数（＞184.03 nmol/L）的儿童智商等级为中下的概率增加了2.25倍（OR=3.25,95%CI:1.22,8.70）,智商等级为超常的概率减少了87%（95%CI:0.28,0.98）。中介效应分析结果显示,AChE浓度升高介导了水氟与IQ得分降低的6.8%（95%CI:2.2%,18.9%）,同时介导了尿氟与IQ得分降低的7.7%（95%CI:2.6%,20.5%）。结论:低中度氟暴露与儿童胆碱能系统失调以及IQ得分降低有关。AChE与儿童拥有超常及以上IQ概率降低有关,并在一定程度上介导了氟暴露与IQ得分降低之间的关联。