【摘 要】
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半乳凝集素（Galectins,Gal）是一类进化保守的动物凝集素,能够通过糖识别结构域（Carbohydrate-recognition domain,CRD）特异性识别β-半乳糖苷。研究表明半乳凝集素具有调节细胞生长、凋亡、迁移、粘附、信号转导以及免疫等多种功能。人体中Gal-10、-14和-16表达含量的改变或表达功能的障碍通常与免疫和炎症等生理及病理活动密切相关,为此寻找其抑制剂/配体十分
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半乳凝集素（Galectins,Gal）是一类进化保守的动物凝集素,能够通过糖识别结构域（Carbohydrate-recognition domain,CRD）特异性识别β-半乳糖苷。研究表明半乳凝集素具有调节细胞生长、凋亡、迁移、粘附、信号转导以及免疫等多种功能。人体中Gal-10、-14和-16表达含量的改变或表达功能的障碍通常与免疫和炎症等生理及病理活动密切相关,为此寻找其抑制剂/配体十分重要。果胶结构复杂,功能多样,是药用植物的主要活性成分之一。其中薄荷、威灵仙和半边莲果胶具有免疫调节、抗炎及抗氧化等功能,可能为抑制半乳凝集素的潜在候选分子。所以本论文以Gal-10、-14和-16三种半乳凝集素,薄荷、威灵仙和半边莲三种果胶为研究对象,研究了半乳凝集素与果胶的相互作用,为寻找天然的半乳凝集素抑制剂/调节剂提供信息。目前,稳定、大量制备Gal-10、-14和-16存在一定难度,表达及纯化的条件中存在不稳定因素,导致得率较低,限制了其应用。其中Gal-10在透析过程中大量析出,通过优化透析液中缓冲液的浓度、pH值和盐浓度,明显克服了Gal-10在透析时大量析出的问题,并且得率稳定在24.0 mg/L左右,纯度＞90%。Gal-14和Gal-16经诱导后可溶性蛋白表达量较低,主要以包涵体形式存在。通化优化Gal-14的诱导条件和缓冲体系,优化Gal-16的缓冲体系和缓冲液的盐浓度,提取包涵体蛋白,显著提高了Gal-14和Gal-16的得率。得率分别为111.6 mg/L、72.0 mg/L,纯度均大于90%。利用优化后的条件制备半乳凝集素,其纯度在与文献报道一致的情况下,得率均显著提高。红细胞凝集实验检测三种半乳凝集素活性的结果显示:Gal-10、-14和-16诱导红细胞凝集的最小浓度范围分别为62.5-125μg/mL、39-78μg/mL和43.5-87μg/mL,表明制备的三种半乳凝集素均具有诱导红细胞凝集的活性。经水提醇沉、DEAE-Cellulose离子交换柱层析和Sepharose CL-6B凝胶柱层析从薄荷、威灵仙和半边莲三种药用植物中分离纯化出电荷及分子量分布均一的三种果胶。利用高效液相色谱法、TBA定性检测结合核磁分析表明三种果胶均是由RG-Ⅰ、RG-Ⅱ和HG三种结构域组成的混合型果胶。利用果胶酶酶解结合Sephadex凝胶色谱制备出各自的RG-Ⅰ、RG-Ⅱ和寡聚半乳糖醛酸（GalA）片段。其中薄荷果胶RG-Ⅰ:RG-Ⅱ:寡聚GalA=22:17:45,RG-Ⅰ型果胶结构域中（Ara+Gal）/2Rha=1.58,侧链含量最高;威灵仙果胶RG-Ⅰ:RG-Ⅱ:寡聚GalA=40:14:24,RG-Ⅰ型果胶结构域中（Ara+Gal）/2Rha=0.71,侧链含量较高;半边莲果胶RG-Ⅰ:RG-Ⅱ:寡聚GalA的含量比例为42:15:20,RG-Ⅰ型果胶结构域中（Ara+Gal）/2Rha=0.34,侧链含量最低。研究Gal-10与三种果胶及结构域的相互作用,结果显示在浓度为2.0 mg/mL时,三种果胶以及酶解后各结构域均不能抑制Gal-10诱导的凝集活性。对比果胶及各结构域对Gal-14和Gal-16的抑制作用可以明显发现RG-Ⅰ型结构域的抑制活性大于RG-Ⅱ,寡聚GalA几乎不具有抑制活性,当同时富含RG-Ⅰ、RG-Ⅱ和寡聚GalA时,半边莲果胶对Gal-14的抑制作用以及薄荷果胶和半边莲果胶对Gal-16的抑制作用会增强,推测RG-Ⅰ为主要的活性结构域,RG-Ⅱ和寡聚GalA的存在可能会促进RG-Ⅰ型果胶发挥抑制活性。各RG-Ⅰ型果胶的抑制活性为薄荷RG-Ⅰ型果胶≥威灵仙RG-Ⅰ型果胶＞半边莲RG-Ⅰ型果胶,推测RG-Ⅰ型果胶中侧链含量（半乳聚糖和阿拉伯糖）越高抑制半乳凝集素诱导的红细胞凝集作用越强。本论文优化了三种半乳凝集素的制备条件,获得了得率较高、稳定性较强且有活性的Gal-10、-14和-16;分离纯化出薄荷、威灵仙和半边莲三种果胶及其结构域;研究了Gal-10、-14和-16与三种果胶及结构域的相互作用。为半乳凝集素和果胶的应用提供了理论基础。
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