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目的:应用携带有C57BL/6小鼠白细胞介素-10(IL-10)基因的慢病毒转染人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs),构建IL-10修饰的hAMSCs(IL-10-hAMSCs),初步探讨IL-10-hAMSCs对小鼠皮肤创面愈合相关因子的调控作用中hAMSCs与IL-10同时发挥的作用。方法:1.无菌条件下提取30岁以下健康产妇剖宫产胎盘羊膜,使用胰蛋白酶+胶原酶二步法体外分离提取出hAMSCs,无菌清洁孵箱中培养,提纯传代至3-5代后予以冻存后备用。2.由重庆绿泽森生物有限公司合成C57B6/L小鼠IL-10基因,使用慢病毒作为基因载体并携带GFP荧光蛋白,对hAMSCs进行转染以得到IL-10-hAMSCs,使用荧光倒置显微镜镜下观察绿色荧光表达情况以评估转染效率。3.取8周龄的C57B6/L小鼠120只图表法随机分别为:(1)对照组,(2)hAMSCs组、(3)IL-10-hAMSCs组、每组40只。浓度4%水合氯醛溶液行麻醉后沿背部脊柱等距离对称制作全层皮肤缺损创面模型(1.0×1.0cm),对照组小鼠创面建模后于其创面周围3、6、9、12点钟方向及创面中央注射200μl的PBS缓冲液,hAMSCs组及IL-10-hAMSCs组分别创周多点注射hAMSCs及IL-10-hAMSCs悬液200uL(5×10~5个细胞/100μl)的细胞悬液。4.分别于建模后第1天、3天、7天、14天对小鼠背部创面情况进行观察拍照,拍照后取各组小鼠各10只,腹腔麻醉处死后沿创面周围切取小鼠全层创面及创缘组织,取小鼠创面组织制作石蜡切片后行苏木精-伊红染色,镜下观察创面及创缘炎症情况,计算创面愈合率,公式:创面愈合率=(原始创面面积-剩余创面面积)/原始创面面积×100%,以及采用qPCR检测创面IL-10、TGF-β3、、MIP-1α、MIP-2 mRNA的表达情况,进行统计学分析。结果:1.光镜下h AMSC呈现长梭型或多角形,贴壁细胞群体呈现呈蜂巢状或旋涡状生长,原代接种后可于24h内贴壁并开始增殖,呈旋涡状生长。2.带有GFP荧光蛋白的IL-10慢病毒感染hAMSCs 72h后于倒置显微镜下观察可见视野中90%以上细胞均表达绿色荧光,表明感染后细胞存活率高且感染率高,IL-10-hAMSCs构建成功。3.计算创面愈合率,结果提示至第7天可看出IL-10-hAMSCs组的创面愈合速度相比hAMSCs快,愈合质量最佳,对照组创面愈合速度最慢,第14天可见IL-10-hAMSCs组创面愈合后无明显瘢痕残留,hAMSCs组瘢痕比对照组小。4.创面组织苏木精-伊红染色结果显示:模型建立第1天,观察对照组、hAMSCs组、IL-10-hAMSCs组的小鼠创面组织中有大量炎性细胞浸润,无明显差异;第3天,对照组和hAMSCs组仍有大量炎性细胞浸润,hAMSCs组的炎性细胞浸润程度略小于对照组,多于IL-10-hAMSCs组;第7天,对照组仍有大量炎性细胞浸润,hAMSCs组和IL-10-hAMSCs组炎性细胞浸润量都明显减少,hAMSCs组的炎性细胞仍然较多于IL-10-hAMSCs组,三组创面组织中胶原排列都较紊乱,无明显差异。伤后14天,对照组、hAMSCs组、IL-10-hAMSCs组的炎性细胞浸润量都较少,三组之间无明显差异。5.q PCR法检测各组创面组织标本IL-10、TGF-β3、MIP-1α、MIP-2的m RNA相对表达量,建模后第1d、3d、7d、14d,对照组IL-10表达量分别为:1.0261±0.4656、4.5871±0.3184、6.8933±0.1584、0.4824±0.1414;hAMSCs组IL-10 m RNA分别为:1.4333±0.2681、6.3306±0.5022,16.1559±0.1403、8.8166±0.2333;IL-10-hAMSCs组IL-10表达量分别为:3.6190±0.2166、12.4598±0.9519、22.1927±0.1370、10.5074±0.0283;对照组TGF-β3表达量分别为:1.0040±0.1826、1.4060±0.4699、1.1949±0.5001、0.2185±0.0777;hAMSCs组TGF-β3表达量分别为:1.2094±0.2123、1.1950±0.1331、1.9377±0.2215、0.4363±0.0586;IL-10-hAMSCs组TGF-β3表达量分别为:1.1922±0.1665、1.1426±0.2257、2.8269±0.2616、2.0054±0.9263;对照组MIP-1α表达量分别为:3.8526±0.3464、6.9142±0.1626、3.6482±0.1131、2.2501±0.0461;hAMSCs组MIP-1α表达量分别为:0.3407±0.1979、0.6484±0.0353、0.6114±0.1060、0.7629±0.0494;IL-10-hAMSCs组MIP-1α表达量分别为:1.7952±0.0282、0.4116±0.0141、0.2517±0.0353、0.2118±0.1626;对照组MIP-2表达量分别为:11.1194±0.0494、8.6342±0.0919、5.7217±0.0212、4.6824±0.0355;hAMSCs组MIP-2表达量分别为:1.3771±0.0989、1.8412±0.0424、1.1814±0.0353、0.5532±0.0282;IL-10-hAMSCs组MIP-2表达量分别为:1.0003±0.0070、1.0682±0.0636、1.3757±0.1272、0.7875±0.0565;结果显示各组IL-10表达量在第1d、第3d、第7d逐渐增加,至第14d各组表达量均出现下降,其中IL-10-hAMSCs组IL-10表达量最高,差异具有统计学意义(P<0.05);各组于建模后第1d、第3d后TGF-β3表达量均较低,差异无统计学意义(P>0.05);至第7d hAMSCs组及IL-10-hAMSCs组TGF-β3表达量均有明显升高,其中IL-10-hAMSCs组表达量高于hAMSCs组,空白对照组最低,差异有统计学意义(P<0.05);至第14d各组TGF-β3表达量均较第7d下降,但仍以IL-10-hAMSCs组最高,对照组最低,差异有统计学意义(P<0.05);MIP-1αm RNA自建模后第1d、第3d表达量逐渐增高,第7d后各组表达量均逐渐下降,以IL-10-hAMSCs组下降最明显,hAMSCs组次之,对照组表达量相对最高,第7天后各组间差异有统计学意义(P<0.05);对照组MIP-2在第1d、第3d、第7d、第14d表达量均高于IL-10-hAMSCs组和hAMSCs组,差异具有统计学意义(P<0.05);hAMSCs组MIP-2在1d、第3d、第7d表达量高于IL-10-hAMSCs,差异具有统计学意义(P<0.05);结论:IL-10-hAMSCs在拮抗创面炎症反应方面发挥着IL-10和hAMSCs的协同效应,可有效下调炎症趋化因子MIP-1α和MIP-2的表达,上调TGF-β3的表达促进创面愈合。