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研究目的TH17细胞属于辅助性CD4+T细胞亚群,分泌IL-17A、IL-17F和IL-22等多种效应分子,与类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）、多发性硬化（multiple sclerosis,MS）等多种自身免疫性疾病发生发展密切相关。铁元素作为机体必需的微量元素,在机体免疫应答中发挥重要作用。然而,铁在辅助性CD4+T细胞亚群分化与功能中的作用目前尚不清楚。本研究通过anti-CD71抗体和铁螯合剂DFO阻断T细胞对铁的摄取,探讨铁缺乏对各辅助性CD4+T细胞亚群分化的影响,重点阐述了铁在TH17细胞分化及自身免疫病发生发展的作用和相关机制。实验方法:一、检测anti-CD71抗体对CD4+T细胞内铁含量的影响1.检测CD4+T细胞CD71的表达:以anti-CD3/CD28模拟TCR信号活化na（?）ve CD4+T细胞,流式细胞术检测不同时间点CD4+T细胞表面CD71的表达;利用MOG35-55抗原肽免疫C57BL/6小鼠建立EAE模型,在模型建立的第0、5、10天分离小鼠引流淋巴结和中枢神经系统中的淋巴细胞,用流式细胞术检测其中CD4+T细胞CD71的表达以及IFN-γ、IL-17A的产生。2.Anti-CD71抗体对CD4+T细胞内铁含量影响:以anti-CD3/CD28模拟TCR信号活化na（?）ve CD4+T细胞,实验组分为anti-CD71抗体处理组和anti-CD71抗体+枸橼酸铁胺（FAC）组,48 h后收取细胞,采用免疫印迹检测胞内Ferritin light chain（FTL）蛋白水平。二、探究anti-CD71抗体对CD4+T细胞活化、功能和增殖的影响1.Anti-CD71抗体对CD4+T细胞活化的影响:以anti-CD3/CD28模拟TCR信号活化na（?）ve CD4+T细胞,实验组加入anti-CD71抗体,24 h后采用流式细胞术检测CD4+T细胞CD44、CD62L、CD25和CD69的表达。2.Anti-CD71抗体对CD4+T细胞功能的影响:以anti-CD3/CD28模拟TCR信号活化na（?）ve CD4+T细胞,实验组加入anti-CD71抗体,分别于24 h和72 h收取细胞并提取RNA,qPCR检测CD4+T细胞Il2、Ifng和Tnfa的表达,同时利用流式细胞术检测CD4+T细胞IL-2的表达。3.Anti-CD71抗体对CD4+T细胞增殖的影响:以anti-CD3/CD28模拟TCR信号活化na（?）ve CD4+T细胞,实验组加入anti-CD71抗体,72 h后采用流式细胞术检测CD4+T细胞Ki67的表达。三、探究anti-CD71抗体对CD4+T细胞各亚群体外分化的影响。1.Anti-CD71抗体对TH17细胞分化的影响:以anti-CD3/CD28模拟TCR信号,IL-6+TGF-β1诱导na（?）ve CD4+T细胞分化为TH17细胞,实验组加入anti-CD71抗体。72 h后利用流式细胞术检测CD4+T细胞IL-17A、IL-17F的表达;通过ELISA检测培养上清中IL-17A的水平;采用qPCR检测细胞Il17a、Il17f、Il23r、Rorc和Rora的表达。2.Anti-CD71抗体对TH1、TH2和Treg细胞分化的影响:以anti-CD3/CD28模拟TCR信号,IL-12诱导na（?）ve CD4+T细胞分化为TH1细胞,IL-4诱导na（?）ve CD4+T细胞分化为TH2细胞,TGF-β1+IL-2共同诱导na（?）ve CD4+T细胞分化为Treg细胞,实验组加入anti-CD71抗体。72 h后流式细胞术检测CD4+T细胞IFN-γ、IL-4和Foxp3的表达。3.Anti-CD71抗体对病理性TH17细胞分化的影响:以anti-CD3/CD28模拟TCR信号,IL-6+IL-23+IL-1β+TGF-β1诱导na（?）ve CD4+T细胞分化为病理性TH17细胞,实验组加入anti-CD71抗体。72 h后流式细胞术检测CD4+T细胞IL-17A、IL-17F的表达;ELISA检测培养上清中IL-17A的水平。4.铁回补对TH17细胞分化的影响:na（?）ve CD4+T细胞在TH17或病理性TH17分化条件下培养72 h,实验组分为anti-CD71抗体处理组和anti-CD71抗体+枸橼酸铁胺（FAC）组,流式细胞术检测CD4+T细胞IL-17A的表达。四、探究anti-CD71抗体对EAE模型的调控及其机理。1.Anti-CD71抗体对小鼠EAE的影响:MOG35-55抗原肽免疫C57BL/6小鼠建立EAE模型,通过鞘内注射,以隔天给药的方式对实验组小鼠进行5次anti-CD71抗体治疗,并每天对EAE小鼠的临床症状进行评分。模型构建后的第17天分离小鼠脊髓,通过H＆E和LFB病理切片染色评价脊髓炎性细胞浸润和髓鞘损伤情况;利用流式细胞术检测中枢神经系统中CD4+T细胞各亚群比例变化;体外使用MOG35-55抗原肽刺激小鼠中枢神经系统中的淋巴细胞72 h,通过ELISA检测细胞培养上清中细胞因子水平。2.明确anti-CD71抗体影响小鼠EAE是通过调控TH17细胞分化:MOG35-55抗原肽免疫CD45.1+WT小鼠建立EAE模型,模型构建后的第9天分离小鼠引流淋巴结细胞,在TH17分化条件下使用MOG35-55抗原肽刺激淋巴细胞4天,实验组加入anti-71抗体,随后分选CD4+T细胞回输到已辐照的CD45.2+WT受体小鼠,建立被动转移EAE模型,每天对小鼠EAE临床症状进行评分;模型构建后第15天分离小鼠脊髓进行H＆E和LFB病理切片染色评价脊髓炎性细胞浸润和髓鞘损伤情况;通过流式细胞术检测中枢神经系统中CD45.1+CD4+T细胞IL-17A的表达。五、探讨anti-CD71抗体对TH17细胞致病性的影响1.Anti-CD71抗体对TH17细胞基因表达谱的影响:na（?）ve CD4+T细胞在TH17细胞分化条件下培养72 h,实验组加入anti-CD71抗体,收集细胞进行RNA-seq测序分析,比较实验组与对照组细胞差异性基因表达。2.进一步明确anti-CD71抗体调控TH17细胞致病性进而影响EAE进展:将2D2小鼠的CD4+T细胞在病理性TH17分化条件下培养72 h,随后TCR再次刺激细胞48 h,实验组全程加入anti-CD71抗体,分别将实验组与对照组细胞回输到受体Rag2-/-小鼠,构建被动转移EAE模型。每天对小鼠EAE临床症状进行评分;以流式细胞术检测引流淋巴结和中枢神经系统中CD4+T细胞IL-17A的表达。六、探讨anti-CD71抗体上调IL-2的产生对TH17细胞分化的影响1.Anti-CD71抗体对TH17细胞IL-2表达的影响:na（?）ve CD4+T细胞在TH17细胞或病理性TH17细胞条件下培养72 h,实验组加入anti-CD71抗体,通过流式细胞术检测CD4+T细胞IL-2的表达。2.Anti-CD71抗体上调CD4+T细胞IL-2产生对TH17细胞分化的影响:分选na（?）ve CD45.1+CD4+T和na（?）ve CD45.2+CD4+T细胞,并分别在TH17细胞分化条件下培养,将CD45.2+CD4+T细胞分为实验组和对照组,实验组加入anti-CD71抗体,24 h后撤掉anti-CD71抗体,随后分别将实验组和对照组CD45.2+CD4+T细胞与同样活化24 h的CD45.1+CD4+T细胞等比混合,在TH17细胞分化条件继续培养48 h,以流式细胞术检测CD45.1+CD4+T细胞IL-17A的表达;在对CD45.1+CD4+T细胞和CD45.2+CD4+T细胞体外分化和共培养过程中额外加入anti-IL-2抗体,利用流式细胞术检测CD45.1+CD4+T细胞IL-17A的表达;na（?）ve CD4+T细胞在IL6+TGF-β1+anti-IL-2条件下培养72 h,实验组加入anti-CD71抗体,采用流式细胞术检测CD4+T细胞IL-17A的表达。七、探讨anti-CD71抗体抑制TH17细胞分化的机制1.Anti-CD71抗体对IL-6和TGF-β通路的影响:na（?）ve CD4+T细胞在TH17细胞分化条件下培养,实验组加入anti-CD71抗体,在分化的24 h和48 h利用流式细胞术检测STAT3和SMAD磷酸化情况。2.Anti-CD71抗体对RORγt表达的影响:na（?）ve CD4+T细胞在TH17细胞分化条件下培养72 h,实验组加入anti-CD71抗体,通过流式细胞术和免疫印迹检测细胞RORγt的表达。3.Anti-CD71抗体对RORγt与Il17a基因位点结合能力的影响:na（?）ve CD4+T细胞在TH17细胞分化条件下培养48 h,实验组加入anti-CD71抗体,通过CHIP-qPCR检测RORγt与Il17a基因位点的结合情况。4.Anti-CD71抗体对Il17a基因位点染色质开放程度的影响:na（?）ve CD4+T细胞在TH17细胞分化条件下培养48 h,实验组加入anti-CD71抗体,利用CHIP-qPCR检测Il17a基因位点H3K4me3、H3K27ac和H3K9me3表观遗传修饰标记的变化。八、探究铁螯合剂DFO对TH17细胞分化及EAE发病的影响1.DFO对TH17细胞分化的影响:na（?）ve CD4+T细胞在TH17细胞或病理性TH17细胞条件下培养72 h,实验组加入DFO,通过流式细胞术检测CD4+T细胞IL-17A的表达。2.DFO对小鼠EAE的影响:MOG35-55抗原肽免疫C57BL/6小鼠建立EAE模型,在EAE模型建立前21天,实验组小鼠在EAE模型构建的前21天腹腔注射DFO,每间隔三天注射一次,直到实验结束。每天对EAE小鼠的临床症状进行评分;模型构建后第18天分离小鼠脊髓通过H＆E和LFB病理切片染色评价脊髓炎性细胞浸润和髓鞘损伤情况;利用流式细胞术检测中枢神经系统中CD4+T细胞各亚群比例变化。实验结果:一、Anti-CD71抗体阻断CD4+T细胞对铁的摄取1.流式细胞术检测结果发现,na（?）ve CD4+T细胞受到TCR刺激活化后,CD71表达显著升高;随着EAE病程的发展,引流淋巴结和中枢神经系统中CD4+T细胞CD71、IFN-γ和IL-17A的表达均显著增加。2.免疫印迹结果显示,与对照组CD4+T细胞相比,anti-CD71抗体组CD4+T细胞内FTL蛋白水平显著下降,而anti-CD71抗体+FAC组CD4+T细胞内FTL蛋白水平升高。二、Anti-CD71抗体上调CD4+T细胞IL-2的产生1.流式细胞术检测结果显示,实验组与对照组CD4+T细胞CD44、CD62L、CD25和CD69的表达无显著性差异。2.qPCR检测结果发现,实验组与对照组CD4+T细胞Ifng和Tnfa的表达无显著性差异,而实验组CD4+T细胞Il2的表达显著高于对照组;流式细胞术检测结果显示,与对照组CD4+T细胞相比,实验组CD4+T对IL-2的表达显著升高。3.流式细胞术检测结果显示,与对照组CD4+T细胞相比,实验组CD4+T细胞Ki67表达降低。三、Anti-CD71抗体抑制TH17细胞的体外分化1.流式细胞术检测结果显示,与对照组CD4+T细胞相比,实验组CD4+T细胞IL-17A和IL-17F的表达显著下降;ELISA检测结果显示,实验组细胞培养上清中IL-17A水平显著低于对照组细胞培养上清;qPCR检测结果发现实验组CD4+T细胞Il17a、Il17f和Il23r的表达水平显著下降,但Rorc和Rora表达在对照组和实验组两组之间没有显著性差异。2.流式细胞术检测结果显示,TH1,TH2和Treg细胞比例在实验组与对照组两组之间无显著差异;3.流式细胞术和ELISA检测结果显示,在病理性TH17分化条件下,实验组CD4+T细胞IL-17A和IL-17F的表达显著低于对照组细胞。4.流式细胞术检测结果显示,与anti-CD71抗体处理组相比,anti-CD71抗体+FAC组CD4+T细胞IL-17A表达显著升高。四、Anti-CD71抗体缓解TH17细胞依赖的EAE症状1.相较于对照组,anti-CD71抗体治疗组EAE小鼠临床症状评分显著降低,中枢神经系统中TH17细胞比例明显降低,而TH1和Treg细胞的比例在两组之间无显著差异。2.过继anti-CD71抗体处理组细胞的受体小鼠临床评分,以及中枢神经系统中浸润的CD45.1+CD4+T细胞IL-17A的表达均显著低于过继对照组细胞的受体小鼠。五、Anti-CD71抗体抑制TH17细胞的致病性1.RNA-seq结果发现,与对照组细胞相比,实验组TH17细胞分化相关的基因表达下调,病理性相关的基因表达下调。2.过继anti-CD71抗体处理组2D2 T细胞的受体小鼠临床评分以及中枢神经系统、引流淋巴结中的TH17细胞比例显著低于过继对照组2D2 T细胞的受体小鼠。六、Anti-CD71抗体通过上调IL-2的产生间接限制TH17细胞分化1.流式细胞术检测结果显示,在TH17细胞分化条件下,实验组CD4+T细胞IL-2的表达显著高于对照组CD4+T细胞。2.流式细胞术检测结果显示,相比于与对照组CD45.2+CD4+T细胞共培养的CD45.1+CD4+T细胞,与实验组CD45.2+CD4+T细胞共培养的CD45.1+CD4+T细胞IL-17A的表达显著降低;在anti-IL-2抗体存在条件下,与实验组CD45.2+CD4+T细胞共培养的CD45.1+CD4+T细胞IL-17A的表达和与对照组CD45.2+CD4+T细胞共培养的CD45.1+CD4+T细胞IL-17A表达无显著性差异。七、Anti-CD71抗体降低Il17a基因位点染色质开放程度1.流式细胞术检测结果显示,STAT3和SMAD的磷酸化水平在实验组和对照组两组之间无明显差异。2.流式细胞术和免疫印迹结果显示,RORγt的表达在实验组和对照组两组之间无显著差异。3.CHIP-qPCR结果显示,实验组CD4+T细胞RORγt与Il17a基因位点的结合丰度显著低于对照组细胞。4.CHIP-qPCR结果显示,与对照组细胞相比,实验组Il17a基因位点上促进转录的H3K4me3、H3K27ac表观遗传修饰标记显著降低,而抑制转录的H3K9me3表观遗传修饰标记没有显著性变化。八、DFO缓解TH17细胞依赖的EAE的症状1.流式细胞术检测结果显示,与对照组CD4+T细胞相比,DFO处理组CD4+T细胞IL-17A的表达显著降低;2.相较于对照组小鼠,DFO处理组EAE小鼠临床症状评分显著降低,中枢神经系统中TH17细胞比例明显降低,TH1和Treg细胞在比例在两组之间无显著差异。实验结论:1.Anti-CD71抗体阻断CD4+T细胞对铁的摄取,特异性地抑制TH17细胞的分化并缓解其依赖的EAE临床症状;2.Anti-CD71抗体导致的铁缺乏可上调CD4+T细胞IL-2的表达间接抑制TH17细胞的分化;Anti-CD71抗体导致的铁缺乏可降低CD4+T细胞Il17a基因位点染色体开放程度,限制RORγt介导的Il17a基因转录。3.铁螯合剂DFO抑制TH17细胞的分化并缓解其依赖的EAE临床症状。