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第一部分高表达EP2的MSC向急性肺损伤小鼠肺组织的归巢及其肺保护效应的研究目的:研究EP2高表达对MSC向损伤肺组织归巢及其肺保护效应的影响。方法:慢病毒介导的EP2转染小鼠MSC,转染MSC分成两组:①仅转染含报告基因的Lenti-GFP,记为MSC-GFP组;②转染含报告基因的Lenti-GFP以及含目的基因的Lenti-EP2,记为MSC-EP2组。慢病毒转染后,采用荧光显微镜观察评估转染效率以确定最高效MOI值。并利用RT-PCR和Western-blot分别测定转染前后EP2 mRNA及EP2蛋白的表达水平。此外,将C57BL/6小鼠随机分为Control组(NS+PBS),ALI组(LPS+PBS),MSC-GFP 组(LPS+MSC-GFP),MSC-EP2 组(LPS+MSC-EP2),气道内注入LPS构建ALI小鼠模型,造模4h后按分组给予不同处理,24h和72h后分别进行下列检测:(1)MSC-EP2移植后向损伤肺组织归巢情况:分别使用近红外离体肺脏成像及肺组织荧光镜检评价MSC-EP2细胞在损伤肺组织内的靶向归巢作用;(2)MSC-EP2移植对ALI小鼠肺血管内皮的修复作用:计算肺湿重/体重比评价肺水肿程度,伊文思蓝漏出实验评价肺微血管内皮通透性;(3)MSC-EP2对ALI小鼠肺病理损伤程度的影响:HE染色行组织病理学检查并进行肺损伤评分以评价肺损伤严重程度;(4)MSC-EP2对肺组织局部炎症反应的影响:ELISA法检测肺组织匀浆中IL-1β、TNF-α、IL-10的浓度评价肺部炎症反应的强度,从而综合评价高表达EP2的MSC向ALI小鼠肺损伤组织归巢和促进肺损伤修复的作用。结果:(1)成功构建了高表达EP2的MSC细胞株:RT-PCR和Western-blot检测结果证实,与MSC-GFP相比,含目的基因的Lenti-EP2转染的MSC细胞内EP2 mRNA及EP2蛋白的表达水平均明显增高(P<0.05),提示慢病毒转染成功构建了高表达EP2的MSC细胞株。(2)MSC-EP2能够更加有效地归巢至损伤肺组织:近红外成像及肺组织免疫荧光检测结果均显示,与MSC-GFP组相比,MSC-EP2组中小鼠肺脏的荧光强度显著增强(P<0.05),提示EP2高表达的MSC能够更加有效地归巢至肺组织。(3)MSC-EP2可更显著改善肺水肿程度:肺湿重与体重比值结果显示,与MSC-GFP组相比,MSC-EP2组肺水肿程度明显减轻(P<0.05)。(4)MSC-EP2可更有效的改善LPS诱导的肺血管内皮通透性的增加:伊文斯蓝通透性实验结果显示,与MSC-GFP相比,MSC-EP2组肺组织中伊文斯蓝的浓度明显下降(P<0.05),提示EP2高表达的MSC能够进一步降低ALI肺血管通透性。(5)MSC-EP2更能够改善肺部炎症反应:通过ELISA检测肺部炎症因子水平发现,与MSC-GFP组相比,MSC-EP2组小鼠肺组织中促炎细胞因子IL-lβ和TNF-α的水平明显下降,而抑炎细胞因子IL-10的水平明显升高(P<0.05),提示EP2高表达的MSC能够进一步改善ALI的肺部炎症反应。(6)MSC-EP2移植对ALI小鼠存活率的影响:与MSC-GFP组相比,MSC-EP2组急性肺损伤小鼠的存活率无明显差异(P>0.05)。结论:EP2高表达的MSC能够更有效地归巢至ALI小鼠肺组织,从而提高MSC促进肺血管内皮的修复、改善肺血管的通透性、降低肺部炎症反应、减轻LPS引起的肺组织病理损伤的作用,最终增强MSC的肺保护效应。该研究为提高MSC对ALI的疗效提供了新的方向。第二部分PGE2/EP2介导MSC向损伤肺组织迁移的分子机制目的:探讨PGE2促进高表达EP2受体的MSC向损伤肺组织归巢的分子机制。方法:实验分组:①未接受PGE2处理的MSC,记为MSC组;②接受PGE2处理的 MSC,记为 MSC+PGE2 组;③接受 PGE2 处理的 MSC-EP2,记为 MSC-EP2 + PGE2组。分别做如下检测:(1)Transwell试验和划痕试验检测MSC的垂直迁移和水平迁移能力,明确PGE2/EP2在EP2促进MSC迁移中的作用。(2)Western Blot检测MSCs细胞中FAK和及其下游信号分子ERK1/2的磷酸化表水平,以明确FAK及其下游信号分子ERK1/2是否参与了 PGE2/EP2介导的MSC迁移。(3)分别使用FAK抑制剂PF573228和ERK1/2抑制剂PD98059预处理MSC及MSC-EP2,再分别行Transwell试验和划痕试验检测MSC及MSC-EP2的垂直迁移和水平迁移能力,以阐明FAK途径及其下游信号分子ERK1/2在EP2高表达促进MSC迁移中的地位。结果:(1)PGE2/EP2是EP2促进MSC迁移的重要通路:与MSCs对照组,PGE2处理组的MSCs水平和垂直迁移率均显著增加(P<0.05),提示PGE2可促进MSC迁移;与MSC+PGE2组相比,MSC-EP2+PGE2组的细胞水平和垂直迁移明显增加(P<0.05),提示PGE2通过EP2受体促进MSC迁移。(2)PGE2/EP2介导的MSC-EP2迁移与FAK途经的活化有关:与对照组MSC相比,MSC+PGE2组中MSCs细胞内FAK磷酸化表达水平呈增加趋势,而MSC+PGE2组相比,MSC-EP2+PGE2组中MSCs细胞内FAK磷酸化表达水平亦呈增加趋势,并且与MSC组相比,MSC-EP2+PGE2组中MSCs细胞中FAK磷酸化表达水平明显增加(P<0.05),提示FAK信号通路参与了 PGE2/EP2介导的MSC迁移。(3)FAK途径下游信号分子ERK1/2参与了 PGE2/EP2通路介导的MSC-EP2迁移:与对照组MSCs相比,给予PGE2刺激的MSC细胞中的ERK1/2磷酸化水平明显较高(P<0.05);而与MSC组相比,EP2高表达的MSC中ERK1/2磷酸化水平明显增高(P<0.05),提示ERK1/2信号通路参与了 PGE2/EP2介导的MSC迁移。(4)FAK抑制剂PF573228能够抑制PGE2对MSC-EP2迁移的趋化作用:transwell和划痕试验结果显示,与MSC组相比较,MSC+PF573228组MSCs的垂直和水平迁移均明显减少(P<0.05);与MSC-EP2组相比较,MSC-EP2+PF573228组MSC的垂直和水平迁移也明显减少(P<0.05),进一步提示FAK信号通路参与了 PGE2/EP2介导的MSC迁移。(5)ERK1/2抑制剂PD98059能够抑制PGE2诱导的MSC-EP2迁移:transwell和划痕试验结果显示,与MSC组相比较,MSC+PD98059组MSCs的垂直和水平迁移均明显减少(P<0.05);与MSC-EP2组相比较,MSC-EP2+PD98059组MSC的垂直和水平迁移也明显减少CP<0.05),进一步ERK1/2信号通路参与了 PGE2/EP2介导的MSC迁移。结论:(1)PGE2能够促进MSC-EP2细胞迁移。(2)FAK及其下游的ERK1/2是PGE2/EP2介导MSC迁移的关键信号分子。(3)高表达EP2受体能够通过增强FAK通信号通路的激活及其下游信号分子ERK1/2的活化,从而促进MSC向损伤肺组织的归巢、增强其肺保护效应。该研究揭示了 EP2高表达的MSC向损伤肺组织的归巢和肺保护效应的分子机制,为提高MSC对ALI的疗效提供了理论依据。