牛是牛支原体天然宿主,截止目前全世界也没有解决牛支原体病的最优方法,此前普遍采用大环内酯类等抗生素药物治疗牛支原体疾病。但由于抗生素的滥用,牛支原体易产生耐药性。所以,疫苗的研发成了广大学者关注的焦点,目前美国已研发出灭活弱毒苗,然而保护效果并不明显。因此,急需挖掘更多的候选抗原靶标,用于开发安全有效的牛支原体疫苗。本研究通过克隆牛支原体LppB基因、重组蛋白原核表达、多克隆抗体制备及反应原性分析和兔体保护试验验证LppB具有抗原靶标的潜力。主要结果如下:1.牛支原体LppB基因的克隆及生物信息学分析。通过设计特异性引物将ZYJ5、GT01、PG45三株牛支原体菌株的LppB基因进行克隆并送公司测序比较基因序列同源性。结果表明,LppB基因在牛支原体菌株中具有高保守性,三株克隆株与国内流行的牛支原体菌株HB0801、Tibet-10、Hubei-1等基因序列同源性高达100%。分析其理化性质可知,LppB蛋白含有脂蛋白信号肽、蛋白大小约为74 k Da、蛋白的理论等电点为8.74、亲水性总体均值为-0.542,蛋白质二级结构预测氨基酸数目为619 AA,分子量为69829.61 Da。2.牛支原体LppB蛋白的原核表达和多克隆抗体的制备。优化牛支原体密码子,将p ET30a-LppB质粒转化至表达菌E.coli BL21（DE3）中,并在0.1m M/L IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）诱导表达12h后获得LppB重组蛋白。由于重组蛋白带有His标签,因此,本研究采用Ni-NTA树脂亲和层析法对LppB重组蛋白进行纯化,经Western Blot验证,在74 k Da处获得浓度1.6 mg/m L的目的蛋白。将其与弗式佐剂乳化免疫昆明小鼠后,成功制备LppB多克隆抗体。3.LppB重组蛋白小鼠多克隆抗体效价的测定及反应原性分析。间接ELISA棋盘滴定法测定制备的LppB多克隆抗体效价为1∶25600。用制备的抗体识别不同地区天然牛支原体全菌蛋白,结果表明,LppB多克隆抗体能够在74 k Da处有效单一的识别全菌蛋白中的相应位置,证明其具有良好的反应原性。4.兔体保护试验。日本大耳白兔分为免疫攻毒组和攻毒组,将LppB蛋白与弗式佐剂配伍后免疫试验兔,免疫时长为28d;采用牛支原体07801株菌液（1×10~8CFU/m L）连续攻毒5d,观察2d后进行取材。结果发现,鼻拭子及肺脏病料中可成功分离出牛支原体。免疫攻毒组体温均在38.0-39.5℃正常温度范围区间,攻毒组体温不稳定。兔体内抗体水平呈上升趋势,第0d时D450nm均值为0.048,此后,第7d、14d、21d、28d抗体效价呈倍数增加,攻毒后第35d兔体内抗体水平最高均值为2.801,结果证明疫苗激活了机体的免疫应答,该抗原具有良好的免疫原性。剖检结果肉眼观察下攻毒组肺脏病变严重,部分区域已有实质变化,HE切片中可以看到肺泡隔已失去原有紧凑结构并有大量炎性细胞浸润。免疫攻毒组的组织病理变化相对较轻,HE切片中可以看到肺泡仍有结构部分有少量炎性细胞浸润,结果证明疫苗有效保护了兔体的肺脏,证明LppB具有作为抗原靶标的潜力。综上所述,本研究通过基因克隆、LppB蛋白表达、多克隆抗体制备及兔体试验证明,LppB蛋白具有良好的免疫原性。研究结果为牛支原体疫苗的研发提供了潜在的抗原候选靶标。