论文部分内容阅读
目的：初步确定TNF α、C3a、C5a上调D407 VEGF表达的时相、剂量反应关系，进一步探讨NF-k B转录因子跟VEGF表达上调的关系。
方法：
第一部分：分别用1500U/ml TNF α、100ng/ml C3a、100ng/mlC5a刺激D407细胞，每种刺激物分别刺激8hrs、16hrs、24hrs后，收取细胞上清和细胞，用ELISA法测定细胞上清VEGF浓度，用RT-PCR法测定细胞VEGF mRNA相对水平。每个时间点均设立对照组。
第二部分：实验分为无预处理组和PDTC预处理组(预处理组在加入刺激物之前用100μM PDTC预处理30min)。在每组里，分别用不同浓度的TNF α(1500、3000 U/ml)、C3a(100、300、500ng/ml)、C5a(100、300、500ng/ml)刺激细胞24hrs后，收取细胞上清，用ELISA法测细胞上清VEGF浓度。每组均设置对照组。
第三部分：分别用不同浓度的TNF α(1500、3000 //ml)、C3a(100、300、500ng/ml)、C5a(100、300、500ng/ml)刺激细胞30min，用免疫荧光法检测细胞内P65的分布；用PDTC预处理后，分别用1500、3000 U/mlTNF α刺激细胞30min，用免疫荧光法检测P65。基础状态下免疫荧光为对照。
结果：
第一部分：ELISA：用TNF α、C3a、C5a刺激8hrs时，C3a组比对照组高(19.6％)，而TNF α、C5a组较对照组低(分别低16.6％和24.5％)；刺激16hrs时，TNFα、C3a组明显高于对照组(分别高56.4％和47.4％)，C5a组比对照组略高(3.6％)；24hrs时，TNFα、C3a、C5a比对照组增高的幅度进一步增大(分别为83.7％、57.9％、8.4％)。RT-PCR：刺激8hrs时，C3a组VEGF mRNA的表达较对照组高，TNF α组较对照组低，C5a组跟对照组差别不大；16hrs时，TNF α、C3a组明显比对照组高，C5a组比对照组略高；24hrs时，对照组和TNF α组不能检测到表达，但C3a组仍有较强的表达，C5a组有低水平表达。
第二部分：不同浓度TNF α、C3a、C5a刺激D407细胞24hrs后，各实验组细胞上清VEGF浓度均比对照组高：其中，TNF α组比对照组高43.1％-57.4％，1500U/ml浓度时增加较明显；C3a组比对照组高17.3％-32.1％，300ng/ml浓度时增加最明显；C5a组比对照组高14.7％-31.8％，300ng/ml浓度最明显；PDTC预处理可以部分抑制TNFQ和C5a对VEGF分泌水平的上调，但对于C3a组，PDTC预处理反而进一步增加了VEGF的分泌水平。
第三部分：1500U/ml、3000 U/ml TNFQ刺激30 min后，NF-K B P65发生核转移，100 μ M PDTC预处理30min可以抑制其核转移；不同浓度C3a(100、300、500ng/ml)、C5a(100、300、500ng/ml)刺激细胞30min时，NF-k B P65无核转移。
结论：D407细胞在静息状态下就有一定量的VEGF表达和分泌；TNFα很可能是通过NF-k B上调D407细胞VEGF蛋白分泌和mRNA表达的；C3a、C5a很可能能够上调D407细胞VEGF表达，但很可能跟NF-k B无关。