【摘 要】
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甲壳素是储存量仅次于纤维素的天然海洋生物多糖,来源广泛。而壳聚糖是甲壳素脱乙酰的产物,具有许多优良的生物特性,如天然无毒、生物相容性好、抗病毒、免疫调节作用等。但其在水中的不溶性限制了其发展。而将壳聚糖进行改性,在其链上引入新活性基团是提高壳聚糖水溶性,改善生物活性的有效手段之一。在诸多衍生物中,季铵化可以增加壳聚糖的正电性、提高水溶性和生物活性而备受关注。课题组前期对壳聚糖季铵盐的免疫活性进行了
【出 处】
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中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
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甲壳素是储存量仅次于纤维素的天然海洋生物多糖,来源广泛。而壳聚糖是甲壳素脱乙酰的产物,具有许多优良的生物特性,如天然无毒、生物相容性好、抗病毒、免疫调节作用等。但其在水中的不溶性限制了其发展。而将壳聚糖进行改性,在其链上引入新活性基团是提高壳聚糖水溶性,改善生物活性的有效手段之一。在诸多衍生物中,季铵化可以增加壳聚糖的正电性、提高水溶性和生物活性而备受关注。课题组前期对壳聚糖季铵盐的免疫活性进行了研究,发现低分子量较高分子量的壳聚糖季铵盐免疫活性高,而且可以激活RAW264.7细胞中的MAPK,JAK/STAT和PI3K/Akt通路,调节免疫应答。并发现将壳聚糖季铵盐制备成纳米粒后能显著提高鸡体内的细胞免疫和体液免疫,具有更强的免疫刺激活性,可将其开发为免疫增强剂。而壳聚糖季铵盐的季铵基团的取代度是影响其活性的重要指标之一,但目前没有相关的报道证明多大的取代度能达到最佳的免疫效果。因此,我们制备了不同取代度的壳聚糖季铵盐,筛选免疫活性最佳的取代度,然后将该样品制备成负载牛血清白蛋白的纳米粒,研究其免疫活性作用,为完善壳聚糖季铵盐在免疫增强剂的开发方面提供较全面的理论基础。本文的具体研究结果如下:1.成功制备了6种不同取代度的含乙酰基壳聚糖季铵盐（HACC）和全脱乙酰壳聚糖季铵盐（De-HACC）,并以RAW 264.7小鼠巨噬细胞为模型,进行免疫活性的筛选。结果表明,乙酰基显著影响壳聚糖季铵盐的取代度,脱去乙酰基后,可以得到71%的高取代度;细胞毒性测试表明在适当浓度范围内所有取代度的壳聚糖季铵盐均安全无毒;采用Griess法测定了一氧化氮（NO）的表达量,荧光定量PCR技术测定了IL-6和TNF-α的m RNA表达,发现季铵化程度和乙酰基显著影响NO和细胞因子的表达量,对于不脱乙酰基的壳聚糖季铵化后,30%-HACC的免疫效果优于13%-HACC和23%-HACC,而全脱乙酰的壳聚糖季铵化后,54%-De-HACC的免疫效果优于62%-De-HACC和71%-De-HACC;Caco-2细胞对54%-De-HACC摄取量高于30%-HACC。2.采用离子交联法,三聚磷酸钠为交联剂,分别以30%-HACC和54%-De-HACC为载体包裹牛血清白蛋白,制备了载牛血清白蛋白纳米粒,并对其进行理化性质表征以及免疫活性测定。结果表明:得到的两种纳米粒粒径为100 nm左右,Zeta电位为+10 m V左右,具有良好的生物相容性;透射电镜显示纳米粒成光滑球状结构;聚集性表明54%-全脱乙酰壳聚糖季铵盐纳米粒（54%-De-HACC-Nps）稳定性要高于30%-含乙酰基壳聚糖季铵盐纳米粒（30%-HACC-Nps）;且54%-De-HACC-NPs对NO、IL-6和TNF-α的表达水平及被Caco-2细胞的摄取均高于30%-HACC-NPs,说明54%-De-HACC-NPs免疫活性较强。综上所述,我们证实了取代度在影响壳聚糖季铵盐免疫调节中的重要作用,为之后壳聚糖季铵盐作为免疫增强剂的开发与应用提供参考。
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