研究背景癫痫是严重危害人类健康的慢性脑部疾病之一,癫痫发作易导致认知和行为异常,全世界目前约有5000万癫痫患者,给社会、家庭和个人都带来了沉重负担。颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy,TLE）是癫痫发作中最常见的类型,自发性再发作（spontaneous recurrent seizure,SRS）是其特征,发作大多由颞叶及其附近的病变引起,临床上常表现为感觉、情绪、精神和运动等各种症状。由于颞叶癫痫的发作与海马等边缘系统的病变密切相关,而海马等又参与了记忆、学习、情绪、行为等认知功能的形成,所以,最近有关颞叶癫痫引起的认知功能障碍逐渐受到了人们的重视。认知功能是人类和动物的大脑高级神经活动,主要包括精神、智力活动的各个方面,如感觉、知觉、学习、记忆,其中最主要的是学习和记忆。学习、记忆的形成是十分复杂的,最近的研究表明,海马结构、突触的可塑性、抑制性氨基酸受体、钙离子、一氧化氮（nitrogen monoxidum,NO）等参与了学习与记忆的过程。一些与突触重塑相关的蛋白被认为是突触可塑性的主要调控者。目前,突触重塑相关蛋白在癫痫发作中的作用与机制已有少量报道,但是突触重塑相关蛋白在颞叶癫痫认知功能障碍中的作用和机制却不十分清楚,对颞叶癫痫认知功能障碍的预防和治疗也缺乏有效手段。研究证实,海马是学习记忆的关键脑区,海马中的长时程增强（long-termpotentiation,LTP）现象被看作研究突触可塑性的理想模型,它与学习、记忆过程密切相关,可以作为“记忆的突触模型”或揭示“记忆的神经元机制”。N-甲基-D-门冬氨酸（N-methyl-D-aspartate,NMDA）受体属于兴奋性氨基酸-谷氨酸（glutamate,Glu）受体,被认为是突触可塑性及皮质和海马神经元LTP的主要调控者,构成了中枢神经系统的重要功能如学习和记忆的基础,其中NMDA 2型受体B亚基（NMDA receptor 2B subunit,NR2B）最为重要。NR2B主要分布在前脑区域如海马和纹状体,在中枢神经系统中广泛参与学习记忆、突触可塑性、神经发育、缺血性脑损伤、神经退行性变、癫痫、肿瘤等许多重要的生理病理过程。突触后致密物（postsynaptic density protein 95,PSD-95）,又称SAP90（synapse associatedprotein 90）,是在Glu能突触的突触后密集区发现的一种脚手架蛋白,是膜结合鸟苷酸激酶（guanylate kinas,GK）超家族的成员之一,因分子量为90-95kDa而命名。PSD-95由N端3个PDZ（Dlg,ZO-1/Dlg-homologous region）结构域,1个SH3（src homology 3）结构域和C端无活性的GK结构域组成,这些结构域可分别介导PSD-95家族蛋白质与特异性蛋白质的相互作用,其中PDZ结构域特异性地与NR2B的C端结合构成NR2B/PSD-95复合物,与缺血性中风、老龄化学习记忆障碍、抑郁、Alzhemer’s disease（AD）、癫痫、亨廷顿病和精神分裂症等神经精神疾病密切相关。突触素（synaptophysin,Syp）是神经元和神经内分泌细胞突触囊泡膜上的一种分子量为38kDa的跨膜糖蛋白。Syp可能通过激活酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase,PTK）,使Syp磷酸化,从而调节内源性Glu的释放来影响突触可塑性,与AD、老龄化学习记忆障碍密切相关。实验证明LTP的诱导和Syp的合成是偶联的,如老年动物LTP和Syp合成同步减低。突触小体相关蛋白（synaptosomal-associated protein 25,SNAP-25）是SNARE（soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein（NSF）attachment protein receptor）蛋白超家族的一员,它与家族中另外两个成员syntaxin和synaptobrevin（也称为VAMP,vesicle-associatedmembrane protein）形成稳定的三元复合物,即SNARE复合体,在突触小泡的外排过程中发挥重要作用,直接介导了突触小泡膜与质膜的融合,为由钙离子引发的神经递质释放做好准备。SNAP-25在一系列神经过程中发挥重要作用,包括轴突生长、树突的形成、神经递质的释放和海马LTP的表达。实验证明SNAP-25在海马表达丰富,参与了学习、记忆过程。突触结合蛋白（synaptotagmin,Syt）是一类主要存在于神经及内分泌细胞分泌小泡膜的蛋白质,在哺乳动物已经被鉴定的有15种亚型,其中Syt 1含量最为丰富,能以钙依赖的方式与细胞膜结合,与神经递质释放密切相关。Syt 1分子由N端的跨膜结构域插入突触囊泡膜,胞浆中的C端分为C2A和C2B两个保守结构域,这两个结构域通常作为钙或者其他因子的结合位点,它在突触囊泡胞吐和胞吞两个过程中都发挥作用。目前已证明Syt 1是快速同步释放的Ca²⁺感受器,并且执行此功能的区域主要在C2B区。此外,Syt 1能与SNARE蛋白的末梢受体结合,并且与囊泡内吞作用密切相关。Syt 1对阐明难治性神经疾患发病机制以及治疗等方面具有一定意义。最近研究发现,Syt 1与AD、老龄化学习记忆障碍密切相关。到目前为止,海马区NR2B、PSD-95、Syp、SNP-25、Syt 1的表达与颞叶癫痫导致的认知功能障碍之间有何关系,仍未见报道。本研究建立红藻氨酸（kainicacid,KA）诱导的大鼠颞叶癫痫模型,检测颞叶癫痫大鼠认知功能的变化,应用组织学方法检测海马区神经元丢失坏死情况,利用免疫组化方法观察NR2B、PSD-95、Syp、SNP-25、Syt 1蛋白的表达,应用逆转录聚合酶链反应（reversetranscriptase polymerase chain reaction,RT-PCR）、Western blot检测NR2B、PSD-95、Syp、SNP-25、Syt 1 mRNA及蛋白的表达,探讨颞叶癫痫大鼠认知功能障碍发生的机制。本研究分为两部分:第一部分颞叶癫痫大鼠认知损害与海马区synaptophysin、SNAP-25、synaptotagmin 1的异常表达目的评价KA诱导的大鼠颞叶癫痫模型认知功能损害;研究Syp、SNAP-25、Syt 1在颞叶癫痫认知功能障碍大鼠海马区的表达,探讨导致颞叶癫痫认知功能损害的可能分子机制。方法1.应用腹腔注射系统给药的方法建立KA诱导的大鼠癫痫模型。实验动物分为对照组、KA组,根据是否发展为SRS,KA组又分为颞叶癫痫组（KA+SRS组）、非颞叶癫痫组（KA-SRS组）。2.应用行为学检测方法评价各组大鼠在致痫后6周（weeks,w）的认知功能。3.应用HE、Nissl染色观察KA+SRS组、KA-SRS组大鼠在致痫后6w海马神经元的形态及数目改变。4.应用免疫组织化学染色在电镜下观察各实验组大鼠在致痫后6w海马区Syp、SNAP-25、Syt 1的表达。5.应用RT-PCR检测各组大鼠在致痫后6w海马区Syp、SNAP-25、Syt 1mRNA的表达。6.应用Western blot检测各组大鼠在致痫后6w海马区Syp、SNAP-25、Syt1蛋白的表达。结果1.Morris水迷宫（Morris water maze）、高架十字迷宫（elevated-plus maze）、开场实验（Open field）检测显示,与对照组比较,KA-SRS组大鼠认知功能未见明显区别,KA+SRS组大鼠认知功能出现障碍（P＜0.05）。2.对照组大鼠海马CA1、CA3、齿状回门区锥体细胞结构清晰完整,细胞核结构正常,染色质分布均匀,胞浆内尼氏小体丰富,未见明显神经元丢失坏死。KA+SRS组大鼠海马CA1、CA2、CA3、CA4及齿状回区未见广泛神经元丢失及胶质增生,可见局部神经元丢失和胶质增生。KA-SRS组大鼠海马未见明显神经元丢失。3.Syp、SNAP-25、Syt 1免疫组化研究显示,对照组大鼠海马可见数目较多、深染的棕褐色Syp、SNAP-25、Syt 1阳性神经元,与对照组比较,KA-SRS组无明显差别,KA+SRS组Syp、SNAP-25阳性神经元数目明显较少、染色较浅,Syt1阳性神经元数目明显增多、染色较深。4.RT-PCR研究显示,与对照组比较,KA-SRS组Syp、SNAP-25、Syt 1mRNA表达无明显差别,KA+SRS组Syp、SNAP-25 mRNA表达减弱（P＜0.05）、Syt 1mRNA表达无明显差别。5.Western blot研究显示,与对照组比较,KA-SRS组Syp、SNAP-25、Syt1蛋白表达无明显差别,KA+SRS组Syp、SNAP-25蛋白表达减弱（P＜0.05）,Syt1蛋白表达增强（P＜0.05）。结论1.颞叶癫痫长期反复发作可以导致认知功能障碍。2.本实验中颞叶癫痫长期反复发作6w后未见广泛神经元丢失及胶质增生,可见局部神经元丢失和胶质增生。3.颞叶癫痫长期反复发作可导致Syp、SNAP-25表达减弱、Syt 1表达增强,从而导致认知功能障碍。第二部分颞叶癫痫大鼠认知功能变化与海马区NR2B/PSD-95动态表达的研究目的评价KA诱导的大鼠颞叶癫痫模型认知功能变化;研究NR2B/PSD-95在颞叶癫痫认知功能障碍大鼠海马区的动态表达及抗癫痫药物丙戊酸钠（valproic acid,VPA）对颞叶癫痫认知功能及海马区NR2B/PSD-95表达的影响,探讨导致颞叶癫痫认知功能障碍的可能分子机制。方法1.应用腹腔注射系统给药的方法建立KA诱导的大鼠颞叶癫痫模型。实验动物分为对照组、KA组、KA+VPA组,根据行为学检测时间,以上三个组再各自分为2w、4w、6w三个亚组。2.应用行为学检测方法评价各亚组大鼠认知功能的变化。3.应用Nissl染色观察KA组、KA+VPA组大鼠癫痫长期反复发作后6w海马神经元的形态及数目改变。4.应用免疫组织化学染色在电镜下观察各亚组大鼠癫痫长期反复发作后海马区NR2B/PSD-95的动态表达。5.应用RT-PCR观察各亚组大鼠癫痫长期反复发作后海马区NR2B/PSD-95mRNA的动态表达。6.应用Western blot检测各亚组大鼠癫痫长期反复发作后海马区NR2B/PSD-95蛋白的动态表达。结果1.Morris水迷宫（Morris water maze）、高架十字迷宫（elevated-plus maze）、开场实验（Open field）检测显示KA-2w亚组、对照组及KA+VPA各亚组大鼠的认知功能未见明显区别,KA各亚组大鼠随时间的延长认知功能障碍逐渐加重（P＜0.05）。2.NS-6w、KA+VPA-6w组大鼠海马CA1、CA3、齿状回门区锥体细胞结构清晰完整,细胞核结构正常,染色质分布均匀,胞浆内尼氏小体丰富,未见明显神经元丢失。KA-6w亚组大鼠海马CA1、CA2、CA3、CA4及齿状回区未见广泛神经元丢失及胶质增生,可见局部神经元丢失和胶质增生。3.NR2B/PSD-95免疫组化研究显示,对照组大鼠海马可见数目较多、深染的棕褐色NR2B、PSD-95阳性神经元。与对照组比较,KA+VPA各亚组无明显差别,KA-6w亚组NR2B、PSD-95阳性神经元数目明显较少、染色较浅。4.RT-PCR研究显示,KA-2w亚组、对照组及KA+VPA各亚组大鼠NR2B/PSD-95 mRNA的表达未见明显区别,KA各亚组大鼠随时间的延长NR2B/PSD-95 mRNA的表达逐渐减弱（P＜0.05）。5.Western blot研究显示,KA-2w亚组、对照组及KA+VPA各亚组大鼠NR2B/PSD-95蛋白的表达未见明显区别,KA各亚组大鼠随时间的延长NR2B/PSD-95蛋白的表达逐渐减弱（P＜0.05）。结论1.颞叶癫痫大鼠长期反复发作可以导致认知功能障碍,且随时间延长逐渐加重。2.本实验中颞叶癫痫长期反复发作6w后未见未见广泛神经元丢失及胶质增生,可见局部性神经元丢失和胶质增生。3.颞叶癫痫长期反复发作可导致NR2B/PSD-95表达逐渐减弱,从而导致认知功能障碍。4.VPA可以通过保护NR2B/PSD-95的表达,减轻颞叶癫痫长期反复发作导致的认知功能障碍。研究意义本研究应用KA制造大鼠颞叶癫痫模型,应用行为学方法检测颞叶癫痫导致的认知功能障碍,首次在成体动物水平证实突触重塑相关蛋白如NR2B、PSD-95、synaptophysin、SNAP-25、synaptotagmin 1参与颞叶癫痫发作导致的认知功能障碍,并同时证实了抗癫痫药物VPA可以通过保护NR2B/PSD-95的表达,减轻颞叶癫痫长期反复发作导致的认知功能障碍。本研究的结果从分子生物学水平上进一步阐明颞叶癫痫导致认知功能障碍的可能机制,有助于寻找新的药物作用靶点,研发新的改善颞叶癫痫认知功能障碍的药物。