研究背景 冠心病(Coronary heart disease，CHD)己成为影响人类健康的主要疾病之一，而CHD的药物治疗不能从根本上去除CHD的发病因素——冠状动脉狭窄，所以，CHD的手术治疗得以广泛开展。但是，有相当一部分病人(如多支或远端冠状动脉的弥漫性病变以及闭塞支远端血管细小者)存在手术禁忌症，因此，一些学者设想能通过输入外源性促血管生长因子来刺激缺血区小血管的生长和侧支循环的形成，从而治疗心肌缺血。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)以其强大的促血管生长能力和作用位点的广泛性成为了研究热点之一。由于蛋白质治疗价格昂贵、半衰期短且极不稳定，因而近期的国内外研究均尝试以VEGF基因对心肌缺血进行治疗。虽然许多动物实验和临床研究都证实基因治疗具有不错的疗效，但仍有一些问题亟需明确，其中包括：基因治疗的安全性、新生血管网的实效性和稳定性以及生血管因子种类、目的基因载体及基因运载方式的最佳选择等。本实验针对上述问题进行了一些探讨，涉及VEGF特定第四军医大学博士学位论文载体的构建、特定运载方式的应用及其安全性、实效性评价等方面的问题。研究目的 1.构建VEGF基因与EGFP基因的真核共表达载体pIREsZ一EGFP一hvEGF165，对离体与在体心肌细胞和内皮细胞进行转染，以确定VEGF基因与EGFP基因的表达状况; 2.在体内、外实验中，对NOGA电机械标测系统位置、距离及容量测量的精度进行测定，并分析该方法与其他检测方法的相关性; 3.利用NOGA电机械标测系统区分正常心肌与梗死心肌; 4.评价NooA心内膜注射导管pIRESZ一EGFp一hVEGF165质粒转染的治疗效果及其安全性。研究方法 1.以基因克隆法构建PIRESZ一EGFP一hvEGF165真核共表达载体，采用小量酶切法对重组质粒进行鉴定;以脂质体法介导目的基因转染离体心肌细胞和内皮细胞，以经心外膜心肌内注射法转染在体心肌组织;采用Rl’- pCR、Westem一blotting、荧光显微镜及免疫组化染色等方法分别检测hVEGF165基因与EGFP基因在心肌细胞与内皮细胞中的表达。 2.应用NOGA电机械标测系统对体外己知的点、线、容积进行重复测量，利用统计学方法分析其可重复性和准确性;以NOGA电机械标测系统和左心室造影系统同时测定某些心功能指标，以统计学方法分析其相关性;通过动脉内球囊导管以冠状动脉内栓塞法建立猪心肌梗死模型，以统计学方法分析梗死前、后的NOGA标测值。 3.通过NOGA电机械标测系统以心内膜注射导管进行心肌第四军医大学博士学位论文内质粒转染，观察质粒转染前后血液学指标、超声心动图以及NOGA标测结果的变化情况;术后3个月行冠状动脉造影以了解侧支循环形成情况;处死动物后行组织病理学检查及电子显微镜观察，明确心肌组织中毛细血管的生成情况和缺血局部心肌细胞的结构、功能状况。实验结果 1.琼脂糖凝胶电泳结果证明，hVEGF165基因片段己成功克隆到载体质粒pIREsZ~EGFp内;将构建好的真核共表达质粒p仅EsZ一EGFp七vEGF165和空载质粒pIREsZ一EGFP转染离体和在体心肌细胞、内皮细胞后，发现上述细胞内均有EGFP的表达，离体内皮细胞和离体心肌细胞的EGFP阳性表达率分别为9.48%和3.43%;VEGF的阳性表达仅存在于真核共表达质粒组的内皮细胞和心肌细胞内，离体内皮细胞和离体心肌细胞的VEGF阳性表达率分别为12.58%和4.39%;Rl:PCR检测发现，在体心肌组织内vEGF mRNA水平明显升高，应用Westem一bfotting可检测到VEGF蛋白表达水平明显增高。 2.NOGA电机械标测系统的体外位置、距离测定结果与真实值的差异在0.3%刁.8%之间，体外容积测定结果与真实值的差异<5%，测定值与真实值之间无统计学差异(尸>.05)，其可重复性和准确性都很高;NOGA电机械标测图像与左心室造影图像非常接近，两者的容量测定值差异<8%(尸>.05)，其容积测定数值密切相关(相关系数分别为:二0.95，;二0.93，:=0.96;尸<0.01):在AMI前、后，NOGA电机械标测获得的单极电压 (呱加lar卯tential，Upv)值分别为1 1 .6士2.3 mV和4.9士l.ZmV，下降了58%，两组间有显著性差异(尸<0 .001);在AMI前、后，NOGA电机械标测测得的双极电压(bipolar potential，Bpv)值分别为5.6士2.1 mV和2.2士1.omV，下降了60%，两组间有显著第四军医大学博士学位论文性差异(P<0.001);在AMI前、后，局段线性缩短率(l inear localshortening，LLs)的数值分别为1 3 .3士2.1和5.9士1.3，下降了56%，两组间有显著性差异(尸<0.001)。 3.质粒注射后，实验组与空载质粒组的WBC计数、SGOT、SGPT、LDH和CPK系列测定值之间均无显著性差异，与注射前相比也没有显著性差异(尸>0.1);术后早期(3一7天)，hVEGF165真核共表达质粒组血清VEGF蛋白水平虽略有升高，但与本组注射前及转染空载质粒组注射后相比无统计学差异(尸>0.05)。 4.HE染色可见hVEGF165真核共表达质粒组新生小血管的数目明显高于空载质粒组，在梗死边界区，前者平均每个高倍视野中的毛细血管数目为35.78士4.9个，而后者约为10.9士5.1个，两组间有