论文部分内容阅读
防御素(defensin)是生物体抵御病原体的防御反应过程中产生的一类抗微生物的短肽。由于防御素具有独特的抑菌机理，能够抑制许多病原微生物的生长，并且不易产生耐受性，因此防御素在医学上具有很好的应用前景。生物机体中天然防御素的含量很低，从宿主有机体中直接分离防御素成本太高，因此，通过基因工程手段生产防御素是使其得以广泛利用的一个有效途径。
椭圆小球藻(Chlorellaellipsoidea)是真核细胞，能够作为受体表达需要翻译后加工的蛋白肽链。本研究则是利用椭圆小球藻硝酸还原酶缺失突变体为受体，构建了包含NPTII基因和硝酸还原酶基因(NR)两个筛选标记的兔防御素蛋白NP-1表达载体，采用电激法将目的基因转入椭圆小球藻硝酸还原酶缺失突变体nrm-4，获得了正确表达防御素蛋白的转基因藻，从而表明通过NR基因作为筛选标记并结合硝酸还原酶缺失突变体可作为较好的小球藻生物反应器生产模式。
杜氏盐藻(Dunaliellasalina)又称盐藻，是内陆盐水和沿海盐沼常见的真核藻类。盐藻具有结构简单，生活周期短，操作方便和易于培养等优点。盐藻是迄今为止发现的最耐盐的真核生物之一，能够在0.05～5MNaCl溶液中生存，是研究细胞对胁迫条件耐受性的良好生物材料。本研究是国内首次大规模测定盐藻的cDNA文库序列，对4000个克隆进行了测序，并且对得到的EST序列进行了分析。
具体研究内容及结果如下：
1.构建了兔防御素蛋白的真核表达载体。这个载体主要包NPTII基因、硝酸还原酶基因NR和兔防御素基因NP-1三个基因。并且，后两个基因的启动子序列是一样的，即后两个基因的启动表达全都是由小球藻内源的硝酸还原酶基因的启动子启动的。
2.将构建好的兔防御素真核表达载体电击转化椭圆小球藻硝酸还原酶功能缺失突变体。对得到的转基因藻进行的活性抑菌分析和PCR检测结果表明，31号株系已经能够成功表达出有活性的兔防御素蛋白，是阳性转基因藻。
3.从得到的盐藻cDNA文库中挑取4000个克隆，利用96孔深孔板进行质粒提取。对得到的4000个质粒做测序反应，最终得到有效的EST序列3632个。对这些EST序列进行assemble比对后，得到1245个uniquesequences。