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目的：运用基因工程技术克隆HIV-1 Tat基因，构建真核表达质粒pcDNA 3.1(+)-Tat，并将其转染血管内皮细胞，建立稳定表达Tat的细胞株，研究Tat对内皮细胞膜表面分子PD-L1表达的影响及相关的信号分子转导机制。探讨Tat通过介导内皮细胞高表达PD-L1诱导机体免疫耐受，从而使HIV-1病毒逃逸机体免疫监视的可能机制。
方法：1)以pCV1(Tat and rev)质粒为模板用PCR方法扩增HIV-1 Tat基因，构建真核表达质粒pcDNA 3.1(+)-Tat。2)重组质粒pcDNA 3.1(+)-Tat和对照质粒pcDNA 3.1(+)分别转染血管内皮细胞ECV304,G418筛选获得稳定表达HIV-1 Tat的细胞株。通过RT-PCR，细胞免疫荧光法及荧光素酶活性测定法鉴定Tat蛋白表达。3)RT-PCR、Real-time PCR，FCM分析pcDNA 3.1(+)-Tat ECV304细胞膜表面PD-L1的表达水平；4)Real-time PCR、Western blot、FCM法分析信号分子的磷酸化水平与Tat 诱导细胞高表达PD-L1的相关性。
结果：1)PCR方法获得HIV-1 Tat基因，并将其插入真核表达载体pcDNA3.1(+)，构建重组体pcDNA3.1(+)-Tat，BamHI和XhoI双酶切鉴定重组质粒，得到约261bp的目的片段，大小与理论值相符；DNA 测序鉴定结果与GenBank报告的基因序列完全相符。2)G418筛选获得稳定表达Tat的ECV304细胞株：RT-PCR示转染pcDNA 3.1(+)-Tat质粒的ECV304细胞出现约261bp条带(Tat mRNA的表达)，对照组无目的条带出现；荧光显微镜下观察转染pcDNA 3.1(+)-Tat质粒的ECV304细胞可见红色荧光，表明有Tat蛋白的表达，阴性对照细胞(转染pcDNA 3.1(+)的ECV304细胞)未见红色荧光；荧光素酶活性测定显示，与转染空载pcDNA 3.1(+)的ECV304细胞相比，转染pCDNA3.1(+)-Tat的细胞的RLU值明显增高。3)RT-PCR、Real-time PCR分析显示pcDNA 3.1(+)-Tat ECV304 细胞 PD-L1 mRNA表达水平为对照组细胞即pcDNA 3.1(+)ECV304细胞的20倍左右；FCM结果显示：pcDNA 3.1(+)细胞和pcDNA 3.1(+)-Tat细胞PD-L1阳性细胞百分率分别为23.2[％]和49.7[％]，后者平均荧光强度峰值与前者相比明显右移。4)Western blot检测显示与对照组pcDNA 3.1(+)细胞相比，pcDNA 3.1(+)-Tat ECV304细胞内p-ERK的表达水平明显上调。加入p-ERK抑制剂PD98059后，pcDNA 3.1(+)-Tat ECV304细胞p-ERK的表达被显著抑制，与对照组无明显差异，表明抑制剂抑制了Tat上调p-ERK的活性。同一细胞内检测PD-L1的表达发现pcDNA 3.1(+)-Tat ECV304细胞加入ERK抑制剂后PD-L1 mRNA的表达(Real-time PCR检测)和蛋白表达(FCM检测)均降低，反映抑制剂抑制了Tat介导的PD-L1的表达上调，提示Tat诱导ECV304细胞高表达PD-L1经过了p-ERK信号分子通路。
结论：1)证实HIV-1 Tat可诱导血管内皮细胞ECV304 高表达PD-L1。2)HIV-1 Tat上调ECV304细胞内PD-L1的表达与信号分子ERK的磷酸化有关。