一目的牛痘病毒相关性激酶1(vaccinia-related kinase 1,VRK1)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在细胞中与多种转录因子结合,参与细胞周期调控和DNA损伤应答。目前的研究表明,VRK1与多种肿瘤的发生发展密切相关,但在胶质瘤中的研究甚少。本研究旨在检测VRK1在胶质瘤中的表达,分析VRK1的表达与胶质瘤患者预后的关系,并进一步探讨VRK1在胶质瘤的发生发展过程中发挥作用的机制。二方法1.利用免疫印迹法检测VRK1在正常脑组织及不同级别胶质瘤组织中的表达。2.利用免疫组化法检测85例胶质瘤石蜡切片标本中VRK1与增殖因子Ki-67的表达情况,并用Pearson相关系数法分析VRK1与Ki67的相关性。3.利用Pearson卡方检验统计VRK1的表达与胶质瘤患者的年龄、性别、肿瘤位置、手术方式等临床病理因素间的相关性。4.利用Kaplan-Meier生存曲线和在线数据库GEPIA分析VRK1的表达与胶质瘤患者预后间的关系。5.Western blot检测VRK1在不同的胶质瘤细胞株中的表达情况,筛选出VRK1高表达的细胞株U87和U251细胞;设计合成VRK1-siRNA,转染U87和U251细胞,筛选出干扰效率最高的VRK1-siRNA#4。6.在 U87 和 U251 细胞中分别转染 control-siRNA 和 VRK1-siRNA#4,敲低 VRK1的表达后,利用Western blot检测PCNA和cyclin D1表达的变化;利用流式细胞术(FCM)检测细胞周期的变化;利用CCK-8和平板克隆形成实验研究VRK1对细胞增殖的影响。7.在U87和U251细胞中敲低VRK1表达之后,利用划痕试验和transwell试验检测VRK1对胶质瘤细胞迁移能力的影响,western blot检测细胞迁移相关蛋白E-cadherin、β-catenin、N-cadherin 和 vimentin 的表达变化。8.敲低VRK1表达之后,利用FCM检测U87和U251细胞凋亡程度的变化;利用western blot检测与细胞凋亡相关的蛋白的表达变化。三结果1.Western blot检测结果表明,VRK1在胶质瘤组织中高表达,且随着胶质瘤恶性程度的增加而增强。2.免疫组化结果显示,VRK1和Ki-67的表达均随着胶质瘤WHO分级的增加而增加,并且Pearson相关系数法分析显示,VRK1的表达与增殖因子Ki-67的表达具有明显的相关性(χ2=11.913,p=0.001)。3.VRK1的表达与胶质瘤患者的年龄、性别、肿瘤部位、外科手术方式、肿瘤大小以及有无坏死均不具有统计学相关性,与WHO分级相关(χ2=12.322,p=0.002)。4.Kaplan-Meier生存曲线分析和在线数据库GEPIA分析显示,高表达VRK1的胶质瘤患者的总生存率明显降低。5.VRK1在U87和U251这两种细胞中表达相对较高;这两种细胞转染了 VRK1的小干扰之后,Western blot结果显示VRK1-siRNA#4的干扰效率最高,与转染control-siRNA的对照组相比,干扰率大于65%,因此我们选择VRK1-siRNA#4作为下一步实验研究所需的siRNA。6.将control-siRNA和VRK1-siRNA#4分别转染至U87细胞和U251细胞中,Western blot检测结果表明敲低VRK1的表达后,增殖相关蛋白PCNA及cyclinD1表达均下调;流式检测结果表明敲低VRK1的表达后G1期的细胞数量增加,S期的细胞减少;CCK8试验和平板克隆形成试验结果表明敲低VRK1的表达后细胞增殖受到抑制。7.划痕试验结果显示,在U87和U251细胞中敲低VRK1表达之后,细胞迁移距离明显缩短。transwell试验显示,U87细胞中,对照组迁移到下室的细胞数为212±15.32,干扰组为77±6.43,细胞迁移能力较少了 64%。U251细胞中,对照组迁移到下室的U251细胞为249±17.324,干扰组为97±8.634,细胞迁移能力较少了 61%,提示敲低VRK1表达之后,胶质瘤细胞迁移能力下降。Western blot结果显示,干扰VRK1的表达后,上皮细胞标志分子E-cadherin和β-catenin表达增高,而间质细胞标志分子N-cadherin和vimentin表达降低,8.流式检测结果显示U87细胞中,对照组凋亡率为(8.23±0.75)%,干扰组凋亡率(22.86±1.27)%。U251细胞中,对照组凋亡率为(7.56±0.63)%,干扰组为(24.38± 1.52)%,凋亡的细胞数明显增加,说明敲低VRK1的表达后会促进细胞的凋亡。Western blot结果表明敲低VRK1的表达后能够上调cleaved caspase-3的表达,同时下调Bcl-2的表达。四结论1.VRK1在胶质瘤组织及胶质瘤细胞系中高表达,且与Ki-67及胶质瘤WHO分级具有统计学相关性,并且高表达VRK1的胶质瘤患者可能预后较差。2.VRK1参与调节胶质瘤细胞的增殖、迁移和凋亡,下调VRK1的表达会抑制细胞周期的进程,抑制细胞的增殖与迁移,促进细胞的凋亡。