外源基因如何高效的在受体组织中表达是基因工程研究的关键。而外源基因的表达首先取决于其转录的启动。高等动物基因的表达具有时间和空间性。组织特异性启动子又称为器官特异性启动子。在这类启动子的作用下,基因的表达往往只限于某些特定的组织或器官,同时表现出发育调节等特性。但是到目前为止,分离和获得利用的组织特异性启动子少之又少,并且伴随着活性低组织特异性并不是很高的缺点。国外已分离利用的组织特异性启动子都有专利保护,这极大了限制了我国在转基因动物制药、畜禽的品种改良及各种疾病的靶向基因治疗等方面的应用。本论文选择了猪的骨骼肌特异性表达基因α-actin的启动子作为研究的对象,通过对其克隆、分离及功能验证获得调控能力相对较强的同时又保持肌肉组织特异性的启动子区域,并通过构建双启动子的策略力图改善启动子的活性并保证其组织特异性。为未来筛选可以高效利用的启动子打下基础。主要研究结果如下:　　 1.利用比较基因组学的方法,将猪的骨骼肌特异性表达基因α-actin的DNA序列输入NCBI的BLASTn数据库,搜索获得此基因的上游调控序列。　　 2.选择猪的α-actin基因包含部分第一内含子的上游调控序列2006bp,提交TESS、TFSEARCH及MethPrimer等生物信息学软件对其核心启动子区域、转录因子结合位点、不同转录元件及CpG岛分布情况进行预测预测和分析。发现此段序列存在启动子区的典型特征结构TATA box,含有肌肉组织特异性的诸多转录因子的结合元件,如MyoD、MEF2及MyoG等。　　 3.根据生物信息学软件在线预测的结果,设计缺失引物,以已经扩增获得的2006bp的pMD18-T重组载体为模板,PCR扩增获得6个5’侧翼缺失片段和2个3’侧翼缺失片段。首先将这些片段插入到pMD18-T载体中,抽提质粒,酶切回收目的片段,再将这些片段插入到pGL3-basic载体中的报告基因萤火虫荧光素酶的上游多克隆位点处,构建相应的报告基因表达载体。将这些载体分别转染C2C12、PK.及分化的C2C12细胞,通过双荧光素酶报告系统分析报告基因萤火虫荧光素酶的相对活性,从而获得不同的缺失片段在相同的细胞中及相同的缺失片段在不同的细胞中启动活性的强弱。结果表明这几个缺失片段在分化的C2C12中表达活性最高,其次是C2C12细胞,表达活性最低的是PK细胞。最终获得了相对表达活性最高并同时保持肌肉组织特异性的268bp的核心区段。　　 4.分别设计引物,以pIRES2-AcGFP1为模板,PCR扩增获得启动子CMV560bp、SV40231bp的核心区段。　　 5.通过添加酶切位点的方式,分别将启动子CMV、SV40及初步筛选到的猪的骨骼肌特异性表达基因α-actin启动子区的具备肌肉组织特异性且表达活性相对较高的区段插入到pGL3-basic载体中的报告基因萤火虫荧光素酶的上游多克隆位点处,构建四种分别包含组成型启动子CMV或者是SV40及猪的骨骼肌特异性表达基因α-actin启动子的双启动子的报告基因表达载体。分别将这四种不同的表达载体利用脂质体转染法瞬时转染C2C12、PK及分化的C2C12细胞。通过双荧光素酶报告系统检测荧光素酶的活性。结果发现:(1)CMV或者是SV40可显著改善猪的骨骼肌特异性表达基因α-actin启动子的活性,其中启动子CMV的效果尤其明显。(2)包含不同组合的双启动子的表达载体在分化的C2C12细胞中表达活性最高,依次为C2C12、PK。　　 6.以质粒pDsRed-N1为模板,扩增获得携带酶切位点BglⅡ和HindⅢ的RFP片段,连至重组载体pGL3-basic-Q8的α-actin启动子Q8的下端,此重组载体命名为Q8-R。以此重组载体为模板扩增携带酶切位点ClaⅠ、EcoRⅠ的Q8-RFP片段,连入慢病毒载体pLenti7.3/V5-GW/lacZ中,获得重组载体LV-Q8-R。