热应激(heat stress,HS)指动物对热环境的舒适区上限温度所产生的一系列生理反应。随着温室效应的加剧,夏季持续高温引起的热应激严重影响了家畜的繁殖性能,对畜牧业造成的损失越来越严重。因此研究热应激对家畜繁殖性能的影响对于减少夏季热应激对动物的不良影响,提高经济效益具有十分重要的意义。猪皮下脂肪较厚,汗腺不发达,其体内热量较难通过皮肤蒸发,因此猪很不耐热。公猪对环境温度尤其敏感,高温环境可对公猪的生殖性能产生明显影响,引起精液量减少、精子活力降低、精子畸形率升高。尽管冷冻精液技术已有相当长的历史,但猪冷冻精液由于繁殖成绩不理想未得到大面积应用,因此夏季热应激引起公猪生精能力降低对整个养猪业产生的影响较难通过使用冷冻精液而改善。全面、深入地研究热应激对公猪精子发生过程的影响,可为预防和缓解热应激对公猪繁殖性能的影响提供重要的理论依据。支持细胞间的紧密连接是构成血睾屏障的重要结构,在精子发生过程中起了关键性的作用。它将生精上皮分为基底室和近腔室。细线前期精母细胞必须穿过紧密连接结构进入近腔室才能完成减数分裂过程进而分化为成熟的精子。此外,其屏障作用为精子发生提供了稳定的微环境。热应激可引起紧密连接相关蛋白表达下调及表达异位,从而破坏紧密连接结构。目前关于热应激对紧密连接影响的报道多为在体实验,体外实验也多聚焦于成熟的体外培养的支持细胞,但未成熟的支持细胞内紧密连接相关蛋白是否表达、表达部位如何以及热应激对未成熟支持细胞内紧密连接蛋白的作用均未见报道。尽管热应激可通过改变成熟支持细胞内紧密连接相关蛋白的表达进而影响精子发生,但由于支持细胞间紧密连接是逐步形成的,热应激对未成熟的支持细胞内紧密连接相关蛋白的影响也可能影响成熟后血睾屏障的形成。鉴于此,本文以仔猪睾丸支持细胞为研究对象,探究热应激对未成熟的支持细胞内紧密连接蛋白表达的影响,并解析其中的分子机制。AMPK是真核细胞内能量代谢调节的关键分子,同时也参与调节上皮细胞间紧密连接的功能:AMPK的激活可促进紧密连接形成,敲除AMPK则可导致紧密连接功能丧失,但AMPK对睾丸内紧密连接的调控作用未见报道。另外,热应激常引起细胞内氧化应激水平升高,使细胞遭受氧化损伤。研究发现ROS可通过调节AMPK上游调控分子Ca MKKβ的表达量进而调节AMPK的活性。基于以上研究背景,本研究提出假设:热应激使支持细胞发生氧化应激反应,进而通过抑制AMPK信号通路调控紧密连接相关蛋白的表达。本文所得研究结果如下:1.支持细胞体外HS模型的建立及HS对紧密连接相关蛋白表达的影响首先比较两种热处理方法(43℃水浴30 min与43℃气浴30 min)对支持细胞活力的影响,发现气浴法可引起支持细胞活力发生可逆性下降(降低34.46%,P<0.01),而随着恢复时间的延长,其活力在48 h可恢复至正常;水浴法亦可引起细胞活力降低(降低57.94%,P<0.01),但至热处理后第48 h,活力进一步降低为对照组的29.49%,因此选择43℃气浴30 min作为支持细胞体外热处理模型。利用此模型发现,热处理可通过降低线粒体膜电位显著增加支持细胞早期凋亡率(增加367.87%,P<0.01),撤除热处理后,随着时间的延长,支持细胞早期凋亡率逐渐降低并恢复至正常。利用western blotting及荧光定量PCR对紧密连接相关蛋白(Claudin-11、JAM-A、Occludin、ZO-1)及m RNA进行检测,发现四种蛋白均能在体外培养的未成熟的公猪支持细胞内表达;热处理后紧密连接相关蛋白的m RNA及蛋白水平显著下调;撤除热处理后随着时间的延长,紧密连接相关蛋白表达量逐渐恢复。通过免疫荧光技术对Claudin-11在支持细胞内的表达部位进行检测,发现尽管体外培养的支持细胞间未形成紧密连接结构,但Claudin-11大量表达于支持细胞胞膜、胞质及囊泡膜上,且表达呈弥散型。热处理后Claudin-11仅少量表达于囊泡膜上,撤除热处理后48 h,Claudin-11在支持细胞内的表达可得到恢复。以上结果表明:热处理可引起支持细胞内紧密连接相关蛋白的m RNA及蛋白水平发生可逆性下调,并使Claudin-11的表达部位发生变化。2.AMPK信号通路在HS影响紧密连接相关蛋白表达中的作用本研究首先发现热处理可抑制AMPK活性,使AMPK磷酸化水平降低60.04%(P<0.01),而这一变化可随恢复时间延长逐渐恢复。随后对AMPK上游调控因子(ATP、Ca MKKβ、LKB1)进行检测,发现热处理后支持细胞内ATP水平降低为对照组的48.92%(P<0.01),Ca MKKβ表达量下调为对照组的46.18%(P<0.01),而LKB1活性未见变化。利用Ca MKKβ的特异性抑制剂STO609(10μmol/L,2 h)对Ca MKKβ进行抑制,发现可在热处理后进一步抑制AMPK活性,相比于单独热处理组下降62.19%(P<0.01),而STO609单独作用却对AMPK活性无明显影响,说明热处理通过抑制Ca MKKβ的表达进而抑制AMPK的活性。为了进一步探究AMPK在热处理下调紧密连接相关蛋白表达中是否发挥作用,本研究利用AMPK特异性激活剂AICAR(2 mmol/L,2 h)处理支持细胞,结果发现,先激活AMPK再进行热处理,紧密连接相关蛋白表达量的下降幅度明显减小;随后利用过表达载体pc DNA-AMPK/si RNA对AMPK进行过表达/干涉,结果发现过表达AMPK可部分挽救热处理引起的紧密连接相关蛋白表达下调。免疫荧光结果表明,热处理后Claudin-11在支持细胞中的定位也在AMPK被激活或过表达后发生变化,从仅表达于囊泡膜表面变为弥散于胞质、胞膜及囊泡膜表面。而干涉AMPK后再行热处理,紧密连接相关蛋白表达量较单独热处理组进一步下调,且Claudin-11在支持细胞内几乎检测不到。这说明Ca MKKβ介导的AMPK在热处理调控紧密连接相关蛋白表达中起了关键作用。3.氧化应激在HS调控紧密连接相关蛋白表达中的作用热处理后支持细胞内ROS及MDA水平显著上调,而抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT活性在热处理后显著降低。随着热处理后恢复时间的延长,以上指标均逐渐恢复至正常水平。这表明热处理可使支持细胞内氧化应激水平升高。通过提前添加抗氧化剂NAC(N-acetyl-L-cysteine,N-乙酰半胱氨酸),发现NAC(1 mmol/L,2 h)通过降低热处理后支持细胞内ROS及MDA水平,提高抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT的活性,从而减轻热处理后支持细胞的氧化损伤。同时,NAC的添加亦可降低支持细胞在热处理后的早期凋亡率,进而提高热处理后支持细胞的活性。本研究进一步发现NAC可上调热处理后支持细胞内Ca MKKβ表达量,并提高AMPK的活性,结果说明热处理通过ROS的产生抑制Ca MKKβ的表达,进而抑制AMPK活性。最后本研究还发现NAC的添加可有效缓解热处理引起的紧密连接相关蛋白表达下调和Claudin-11在细胞内异位。综上所述,热处理通过提高支持细胞内氧化应激水平,抑制Ca MKKβ的表达,进而抑制AMPK活性,从而引起紧密连接相关蛋白表达和在细胞中的定位发生可逆性变化。本结论揭示了热处理影响未成熟猪睾丸支持细胞内紧密连接相关蛋白表达的分子机制,这为人工调控热应激对公猪生精的不利影响提供了理论依据。