近年来，食品安全问题频发，消费者对食品安全的关注日益增加。牛奶中残留的青霉素类药物对消费者的身体健康危害很大，因此，本研究的目的是制备能同时识别多种青霉素类药物的单克隆抗体，建立一种多残留免疫检测方法用于牛奶中该类药物的检测。本研究以6-氨基青霉烷酸为模板，合成了两个新的青霉素类药物通用半抗原，并采用戊二醛法和N,N-羰基二咪唑法与载体蛋白偶联合成两种免疫抗原和两种包被抗原。半抗原与载体蛋白的结合比范围在10-15:1之间。用免疫抗原免疫Balb/C小鼠，选择血清效价最高且对半抗原有特异性的小鼠，将其脾细胞与骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞，采用小鼠体内诱生法制备抗青霉素类药物的广谱单克隆抗体。以该抗体为基础建立了一种间接竞争酶联免疫吸附法（ELISA）。以方阵滴定法确定包被抗原和抗体的最适工作浓度分别为10000和400000倍稀释。该方法可以同时检测11种青霉素类药物（阿莫西林，氨苄西林，青霉素G，青霉素V，磺苄西林，甲氧西林，氯唑西林，羧苄青霉素，双氯西林，苯唑西林，萘夫西林），对上述11种药物的IC₅₀为5.0-36.2ng/mL，交叉反应率为16%-117%，最低检测限为0.7-9.3ng/mL。将这11种药物分别按不同浓度添加在空白牛奶中，添加回收率为77.6%-99.4%，变异系数低于13.5%。因此，本研究建立的ELISA方法可以作为牛奶中青霉素类药物残留的快速检测工具，以提供检测效率，保证动物性食品安全。