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虎纹捕鸟蛛(Haplopelma schmidti)、敬钊缨毛蛛(Chilobrachysguangxiensis)、海南捕鸟蛛(Haplopelma hainanum)都分布于我国南方地区，属于体型较大、毒性较强且稀有的捕鸟蛛。在本实验室以前的工作中，分别从它们的粗毒中分离到了虎纹毒素-Ⅰ(HWTX-Ⅰ)、虎纹毒素-Ⅳ(HWTX-Ⅳ)、海南毒素-Ⅳ(HNTX-Ⅳ)、敬钊毒素-Ⅲ(JZTX-Ⅲ)，并通过电生理实验了解这四种毒素对于电压敏感钠通道(VGSCs)具有不同的选择性及作用强度，但是具体相互作用机制仍然不清楚。本文试图利用酵母双杂交技术来部分解决这个问题。将编码毒素成熟肽的基因序列连入pGBKT7(酵母双杂交载体)，将编码电压敏感钠通道膜外区的基因序列连入另一载体pGADT7。通过酵母双杂交的手段，分别检测到了以上四种毒素对hNav1.7、hNav1.5通道膜外区潜在的相互作用位点。HWTX-Ⅳ和hNav1.7的潜在的作用位点仅为通道结构域Ⅲ的S3-S4胞外连接片段(DⅢ-S3-S4)。HWTX-Ⅰ与hNav1.7的潜在的作用位点为DⅠ-S3-S4、DⅢ-S1-S2、DⅢ-S5-S6、DⅣ-S5-S6。HNTX-Ⅳ和hNav1.7的潜在的作用位点是DⅠ-S3-S4、DⅡ-S1-S2、DⅢ-S1-S2、DⅢ-S5-S6。JZTX-Ⅲ和hNav1.7的潜在的作用位点是DⅠ-S3-S4、DⅠ-S5-S6、DⅡ-S1-S2、DⅢ-S5-S6、DⅣ-S1-S2、DⅣ-S5-S6。进一步分析，发现JZTX-Ⅲ与hNav1.5的潜在的作用位点是DⅠ-S1-S2、DⅡ-S3-S4，DⅢ-S3-S4。
在本实验室以前的工作中，已经在膜片钳上检测了天然HWTX-Ⅳ对hNav1.7通道电流的抑制作用，其半数抑制量(IC50)为26 nM；JZTX-Ⅲ对bNav1.5有抑制作用，其IC50大约在300 nM附近(未发表数据)。本文中我们又在膜片钳上检测了天然的HWTX-Ⅰ，HNTX-Ⅳ，JZTX-Ⅲ对于hNav1.7通道电流的抑制能力。其中毒素HWTX-Ⅰ，HNTX-Ⅳ对于hNav1.7通道电流的IC50分别为640 nM和22 nM。JZTX-Ⅲ在1μM浓度时，对hNav1.7通道电流没有明显抑制能力。这四个毒素对hNav1.7通道电流的抑制能力依次是：HNTX-Ⅳ≈HWTX-Ⅳ>HWTX-Ⅰ>>JZTX-Ⅲ。
通过综合分析酵母显色和电生理的结果我们可以得出：1)HNTX-Ⅳ和HWTX-Ⅳ对hNav1.7通道的S5-S6这些膜外区中的大部分并没有相互作用；2)虽然电生理的结果，HNTX-Ⅳ和HWTX-Ⅳ对hNav1.7电流的抑制能力十分接近，但是通过分析酵母相互作用的结果，两者的作用位点却差异明显。其中HWTX-Ⅳ能够检测到的作用位点仅有一个，而HNTX-Ⅳ有4处；3)通过分析酵母显色结果，我们发现通道hNav1.5与hNav1.7之间，很可能是由于DⅡ-S3-S4和DⅢ-S3-S4这两部分膜外区的差别，导致对JZTX-Ⅲ敏感性的不一样。
虽然VGSCs在S1-S2、S3-S4膜外区的氨基酸在10个附近，但是在我们参看相关文献后，预测其核心序列在6个氨基酸左右，我们直接在酵母双杂交载体pGADT7的多克隆位点上插入编码随机的六个氨基酸的序列，从而组成一个随机六肽文库。我们通过2种方式构建了能够用于酵母双杂交的随机六肽文库。第一种方法是常规的，需要依赖酶切和连接的方式；而第二种方法是直接通过PCR来完成文库质粒构建的全新方法。两种方法均能得到库容量在10万左右的高质量随机六肽文库。随后对两种方法所得的文库，随机挑选20个克隆进行测序。测序结果表明：两个文库都有70％的序列是符合设计初衷的编码随机六肽的序列，并且没有一个重复序列，代表两个文库里面的复杂度良好。
本文的另一个工作是建立了一种表达小分子生物活性多肽的方法。我们分别将编码虎纹毒素-Ⅰ(HWTX-Ⅰ)，海南毒素-Ⅳ(HNTX-Ⅳ)，敬钊毒素-Ⅴ(JZTX-Ⅴ)的序列通过聚合酶链式反应(PCR)手段获得，然后分别连接入表达载体pET-40b，接着转入表达菌株BL21(DE3)，最后以乳糖为诱导物，来实现目的蛋白在大肠杆菌周质空间的融合表达。经过SDS-PAGE检测，均能检测到三种毒素以融合蛋白的形式表达。进一步将部分可溶的虎纹毒素-Ⅰ融合蛋白(带组氨酸标签)用镍柱纯化。纯化后的产物通过透析、除盐后，再加入肠激酶消化来释放重组的虎纹毒素-Ⅰ(rHWTX-Ⅰ)，接着通过反相高效液相色谱法(RP-HPLC)来纯化rHWTX-Ⅰ。经质谱检测，rHWTX-Ⅰ的分子量和天然HWTX-Ⅰ一样，都为3750.69，表明rHWTX-Ⅰ已经形成了3对二硫键。随后通过全细胞膜片钳技术来检测rHWTX-Ⅰ的生理活性。rHWTX-Ⅰ抑制hNav1.7电流的IC50为640 nM，几乎和天然的一致(天然的HWTX-Ⅰ的IC50为630 nM)。