Stathmin基因是一个与恶性肿瘤发生、发展密切相关的癌基因,研究表明,该基因在大多数的恶性肿瘤中均呈过表达状态,阻断它的表达可有效的逆转恶性肿瘤的生物学表型。然而目前,关于stathmin基因过表达的调控机理却尚未完全阐明,我们对stathmin基因5’端的启动子区及其相关转录调控因子进行了较全面的分析研究,以期最终揭示恶性肿瘤细胞中stathmin基因过表达的调控机理,希望为发掘恶性肿瘤诊治新靶点奠定坚实的基础。目的:为了研究stathmin基因转录调控机制,首先从基因组DNA中扩增stathmin基因启动子序列,并且对其活性进行检测,然后用PCR的方法获得不同截短型的stathmin基因启动子,确定stathmin基因启动子核心区,接着对核心启动子序列进行分析,预测对其有调控作用的一些重要转录调控因子,最后研究这些转录调控因子对stathmin基因启动子的调控作用,并探讨它们在恶性肿瘤细胞中对stathmin基因过表达的作用机制,以期从转录调控的角度揭示stathmin基因过表达的机理。方法:(1)首先设计合成扩增全长stathmin基因启动子序列的引物,以A549细胞基因组DNA为模板,通过PCR的方法,扩增stathmin基因启动子;然后,我们将全长的stathmin基因启动子连入启动子活性检测的专用载体pGL3-Basic/LUC和pGL3-Basic/EGFP中,命名为pGL3-Basic/LUC/stap和pGL3-Basic/EGFP/stap,将重组质粒分别转染293细胞和A549细胞,检测报告基因荧光素酶和绿色荧光蛋白的表达情况,验证stathmin基因启动子的活性。(2)设计合成扩增不同截短型stathmin基因启动子的引物,通过PCR的方法扩增相应的启动子片段,并且连入启动子活性检测专用载体,通过报告基因的表达情况检测启动子的活性变化。(3)用启动子分析软件对核心启动子序列进行分析,发现在核心启动子上存在E2F1、NF-Y、Sp1及Egr1的结合位点,针对这些结合位点,设计合成含有预期突变位点的引物,然后以待突变的质粒为模板,进行PCR扩增反应,构建含有预期突变位点的报告基因重组质粒,转染细胞,检测报告基因的表达变化;接着进行染色质免疫共沉淀试验,通过转录调控因子E2F1、NF-Y、Sp1及Egr1特异性抗体的作用,得到与它们相结合的DNA片段,然后通过PCR扩增,验证这些转录调控因子在细胞内是否可以与结合位点直接结合。(4)在过表达和干涉实验中,构建E2F1、NF-Y、Sp1及Egr1全长的真核表达载体和干涉载体,转染A549细胞,RT-PCR和Western Blot检测相应转录调控因子及stathmin基因的表达情况。(5)通过不同方法(PMA、UV、DOX等)上调Egr1的表达,然后从mRNA和蛋白水平检测stathmin的表达情况;构建Egr1位点突变的全长stathmin基因启动子报告基因载体,检测启动子活性变化;通过染色质免疫共沉淀和凝胶迁移试验检测Egr1与stathmin基因启动子的结合情况;通过不通的方式(UV、DOX及p53真核表达载体等)作用于A549细胞和A549-KE细胞(转染了Egr1干涉载体),通过荧光素酶报告基因系统和Western Blot检测stathmin基因启动子的活性及表达的改变。结果:(1)获得的stathmin基因启动子经测序和双酶切鉴定证实所扩增序列与GenBank中报道序列一致,将pGL3-Basic/LUC/stap和pGL3-Basic/EGFP/stap载体分别转染293细胞和A549细胞,检测报告基因的表达,结果表明:stathmin基因启动子可以调控报告基因的表达,并且它的启动子活性明显强于另一个肿瘤相关启动子survivin基因启动子。(2)运用PCR的方法获得了不同截短型的启动子片段分别为:1500 bp、1000 bp、600 bp、400 bp及200 bp,通过酶切及测序鉴定所获得的不同长度的启动子序列正确,同时对它们的调控活性检测结果表明,报告基因均显示400 bp的启动子片段活性最强。(3)位点突变试验中,成功构建了含有预期突变位点的重组报告基因质粒,通过报告基因的检测,发现E2F1、NF-Y、Sp1结合位点突变以后,核心启动子的活性均有或多或少的减弱,而Egr1结合位点突变以后,核心启动子的活性明显增强;染色质免疫共沉淀试验证实了这四个转录调控因子都可以和stathmin基因核心启动子上的预测位点直接结合。(4)在过表达试验中, E2F1、NF-Y、Sp1的增加可以不同程度的上调stathmin基因的表达,而Egr1表达的增加则可明显下调stathmin基因表达水平;干涉试验中,E2F1、NF-Y、Sp1的表达降低可以不同程度的下调stathmin基因的表达,而Egr1表达的降低则可明显上调stathmin基因的表达水平。(5)增加细胞内Egr1的表达可以从mRNA和蛋白水平减低stathmin的表达;Egr1可以与stathmin基因启动子上的Egr1位点直接结合,调控stathmin基因启动子的活性;在A549细胞中,通过上调p53的表达,可以诱导Egr1的表达增加,使得stathmin基因的表达水平下降;但是在A549-KE细胞中,上调的p53并没有改变Egr1和stathmin基因的表达水平。结论:(1)获得了全长的stathmin基因启动子,并且经测序鉴定,与GeneBank中报道的序列一致;而且通过对该启动子活性的检测发现,stathmin基因启动子的活性明显强于另一个与肿瘤相关的survivin基因启动子。(2)获得了正确的不同截短型的启动子片段,并且确定了400 bp的stathmin基因启动子核心区域。(3)转录调控因子E2F1、NF-Y、Sp1及Egr1可以通过作用于stathmin基因核心启动子上的相应结合位点,调控核心启动子的活性。(4)E2F1、NF-Y、Sp1及Egr1均能够调控stathmin表达,其中E2F1、NF-Y、Sp1可以不同程度的上调它的表达,而Egr1则能够下调stathmin的表达,并且Egr1的调控作用最明显。(5)转录调控因子Egr1可以从转录水平抑制stathmin表达,p53能够通过Egr1介导对stathmin基因发挥转录抑制作用。