论文部分内容阅读
硫化氢（H2S）作为继一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后的第三种气体信号分子,近年来被科研工作者做了广泛而又深入的研究。随着H2S在调节动物生命活动,促进植物的生长发育和增强植物抗逆性等方面作用机制研究的不断深入,有关动植物中催化内源性H2S产生的酶也被系统的报道:在动物中,目前发现有三种酶与内源性H2S的产生有关,分别是胱硫醚γ-裂解酶（CBS）、胱硫醚β-合酶（CSE）以及3-巯基丙酮酸硫转移酶（3-MST）。而在植物中,有四大类能够催化内源性硫化氢产生的酶:分别是半胱氨酸脱巯基酶（CDes）、β-氰丙氨酸合酶（CAS）、半胱氨酸脱硫酶和O-乙酰丝氨酸硫醇裂解酶（OASTL）,其中,CDes中的L-半胱氨酸脱巯基酶（LCD）和L-半胱氨酸脱硫水化酶（DES1）的相关突变体材料也被广泛用于H2S的生理作用和信号通路的研究当中。在植物通过半胱氨酸合成甲硫氨酸的过程中,胱硫醚β-裂解酶（CBL）发挥了重要作用,它可以裂解胱硫醚生成同型半胱氨酸,而后,甲硫氨酸合酶会催化同型半胱氨酸,进而生成甲硫氨酸,这是CBL的一个最广为人知的功能。CBL与动物细胞中的CSE关系很近,序列一致性达到43%,相似性达到了64%,但植物中的CBL是否具有与动物中的CSE相似的能够催化内源性H2S产生的功能,目前尚未有人报道。本文主要运用原核表达的方法,分析了模式植物拟南芥中的CBL与H2S产生的关系,结果如下:1.构建表达载体:将拟南芥CBL编码基因（AtCBL,At3g57050）克隆到原核表达载体pET28a上,测序成功后,将重组的pET28a-AtCBL质粒转化大肠杆菌（E.coli）BL21（DE3）感受态细胞,命名为BL21（DE3）/pET28a-AtCBL。同时将pET28a质粒转入BL21（DE3）感受态细胞中,命名为BL21（DE3）/pET28a。2.优化蛋白表达诱导条件:加入异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导大肠杆菌BL21（DE3）/pET28a-AtCBL蛋白表达,优化后的IPTG终浓度为0.05 mol·l-1,在20℃条件下诱导培养20 h。同时,在相同条件下诱导BL21（DE3）/pET28a和BL21（DE3）蛋白表达,并设置不加IPTG而用等量双蒸水代替的对照组。在IPTG诱导下,BL21（DE3）/pET28a-AtCBL表达出AtCBL蛋白,其它大肠杆菌中未见该蛋白的表达。3.H2S产率的测定:以L-半胱氨酸为底物,分别测定IPTG诱导下BL21（DE3）/pET28a-AtCBL,BL21（DE3）/pET28a和BL21（DE3）三种大肠杆菌和未加IPTG诱导的三种大肠杆菌的细菌裂解液中可溶性蛋白催化H2S产生的速率。结果显示,在IPTG诱导下的BL21（DE3）/pET28a-AtCBL裂解液中可溶性蛋白的H2S产率显著高于其它大肠杆菌,从而证明重组AtCBL蛋白具有催化H2S产生的活性。综上所述,本研究通过原核表达和一系列对照实验,证明拟南芥AtCBL蛋白具有以L-半胱氨酸为底物,催化H2S产生的新功能。