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金属p-内酰胺酶(MβLs)包括NDM-1正在引发一场生物医学危机,目前尚无任何应对措施。用质粒pET26b(+)L1在大肠杆菌中表达并纯化B3亚组金属p-内酰胺酶之代表L1,研究其分子生物学特性、作用机理及活性部位不同金属离子的作用等,将为发展新的酶抑制剂并进而对付耐药细菌提供了基础。本文①在实验室将含金属p-内酰胺酶L1基因的质粒转移并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,37℃、pH 7.5的LB中培养细胞,IPTG诱导蛋白生产,诱导时间3-4小时,FPLC以4 ml/min的流速洗脱,SDS-PAGE确认蛋白,获得纯化的L1,产率为每升培养液10-15mg蛋白。②成功制备了Co(Ⅱ)-L1重组蛋白,测定了Co(Ⅱ)-L1和野生型L1催化3类9种抗生素水解的动力学参数,并对其进行了荧光,UV-Vis和CD表征。动力学表征结果表明,野生型L1对碳青霉烯类抗生素的酶促活性最强,青霉素类次之,头孢类抗生素较弱；比较野生型L1,Co(Ⅱ)-L1催化青霉素G,先锋霉素(V)和法罗培南水解的催化常数Kcat值分别降低了2.6、1.4和4.8倍；UV-Vis表征结果显示,Co(Ⅱ)-L1在340 nm和500-600 nm有吸收谱带；荧光光谱表征结果表明,Co(Ⅱ)-L1的发光强度和发光波长较Apo-L1有显著变化；圆二色谱表征发现,Co(Ⅱ)-L1的二级结构发生变化。③首次成功制备了稀土离子重组蛋白La(Ⅲ)-, Ce(Ⅲ)-, Pr(III)-和Nd(Ⅲ)-L1,并对其进行了动力学、荧光和CD表征,探索其活性点金属离子的作用及对不同抗生素的催化活性。ICP检测结果说明,除Nd(Ⅲ)-L1外,重组蛋白中稀土离子的含量约为1.0±0.3/每个蛋白分子,该结果和荧光光谱表征结果一致；CD表征表明,活性中心金属离子被稀土离子代替时不引起蛋白二级结构的变化,稳态动力学结果证明,重组的蛋白对不同类的抗生素呈现出不同的催化活性,其活性比野生型L1高出3-4倍。