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目前,在大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)中高效表达的包涵体蛋白的复性仍然是获得高活性、高质量重组蛋白药物的“瓶颈”。蛋白质折叠液相色谱(Protein folding liquid chromatography,PFLC)法已经成为快速、有效地复性与同时纯化包涵体的重要手段。PFLC具有分离效果好、适用性强和易于规模化制备等优点,其中以疏水相互作用色谱(HIC)法与离子交换色谱(IEC)法正交的混合模式色谱(Mixed mode chromatography,MMC)固定相对蛋白质折叠效率的提高发挥着重要作用。前期工作,我们合成了以胆酸、苯乙胺、苯丙胺和色氨酸为配基的四种以HIC为主,IEC为辅的MMC固定相,成功地实现了还原变性溶菌酶和在E.coli中表达的带有RGD的重组人Notch配体Delta-like 1融合蛋白(RGD-rhDll1)的复性与同时纯化。研究发现,在HIC模式下,这类含有选择性静电作用力的PFLC固定相对蛋白质复性具有促进作用。因此,为了更加深入的研究这类固定相对不同蛋白质复性与纯化的作用效果,本论文中,首先在大肠杆菌中表达了重组人Notch配体Delta-like 1(简称rhDll1),并对rhDll1工程菌的培养条件进行了筛选。本论文中的rhDll1与以往研究中rhDll1不同的是去掉了融合短肽,如组氨酸标签、RGD导向肽标签,不需要后续融合标签的切割。但是,表达的rhDll1仍然以不可溶包涵体形式存在。因此,获得的rhDll1细胞菌体需要经超声波细胞破碎,缓冲液洗涤和回收,并溶解于8.0 M脲得到粗分离的包涵体;同时以前期研究为基础,分别合成、表征和装填以胆酸、苯乙胺、苯丙胺和色氨酸为配基的四种固定相分析型和半制备型的色谱柱。在不同规模下,利用不同配基的色谱柱对rhDll1包涵体进行复性与同时纯化的研究,为解决柱上包涵体的复性难点提供可靠的数据。本论文内容分为四个部分:1.文献综述由于该研究涉及生命科学、分离科学等相关领域的工作,因此,在这个章节分别对调控细胞增殖分化的最重要的信号途径(包括Notch信号通路、Notch配体与受体蛋白)、大肠杆菌高效表达重组蛋白(包括可溶性、不可溶重组蛋白)的特点以及PFLC法对蛋白质复性与纯化的研究进行文献综述。2.重组人Delta-like 1工程菌筛选及其包涵体的粗分离本章研究了发酵条件对工程菌生长及目标蛋白表达的影响,结果显示,将4%的菌液接至培养基LB中,在温度为37℃、摇床转速为220 r/min的条件下进行培养,在对数生长期即培养后3～3.5 h时,加入IPTG诱导剂进行诱导,4 h后其表达量可达40.5%。通过对包涵体粗分离过程分析发现,增加洗涤次数会增加蛋白损失、提高目标蛋白纯度。最终,溶解于8.0 mol/L urea的包涵体其蛋白含量为5.6 mg/mL,蛋白纯度可达到55.6%。3.不同的疏水相互作用色谱柱对重组人Delta-like 1蛋白的复性与同时纯化利用4种不同配基固定相对rhDll1进行复性并同时纯化的研究。首先合成以胆酸、苯乙胺、苯丙胺和色氨酸为配基的4种MMC固定相,并装填色谱柱,经标准蛋白质评价后,对rhDll1复性与纯化的色谱条件进行筛选,包括洗脱梯度、进样量、流动相pH、流动相脲浓度、流动相盐浓度变化。实验发现,在HIC模式下,固定相配基的静电作用基团,对蛋白复性具有不同的促进作用。在优化色谱条件下,rhDll1均能在这四种色谱柱上得到保留,其质量回收率分别为69.3%(色氨酸)>62.8%(苯乙胺)>59.3%(胆酸)>59.2%(苯丙胺),蛋白纯度为95.8%(苯乙胺)>94.5%(胆酸)>93.3%(色氨酸)>93.2%(苯丙胺)。荧光光谱和圆二色光谱分析复性前后rhDll1的构象变化确认,在4种不同配基的固定相上均可以实现rhDll1复性与同时纯化,可分别获得浓度为0.12mg/mL(苯乙胺)、0.09mg/mL(苯丙胺)、0.19mg/mL(色氨酸)、0.19 mg/mL(胆酸)的 rhDll1。4.放大规模的疏水相互作用色谱柱对重组人Delta-like 1蛋白的复性与同时纯化基于色谱柱条件的优化,利用装填的“色谱饼”放大规模进行了 rhDll1的复性与同时纯化研究。通过对负载量、流速等条件优化,结果显示,rhDll1在四种固定相装填的色谱饼上均能得到保留,在优化条件下,rhDll1的质量回收率分别为62.6%(色氨酸)>59.8%(苯乙胺)>55.8%(胆酸)>53.2%(苯丙胺),纯度分别为95.2%(胆酸)>94.9%(色氨酸)>93.7%(苯乙胺)>93.2%(苯丙胺)。采用 SDS-15%PAGE和质谱(MALDI-TOF-MS)分析蛋白纯度及分子量,荧光光谱法和圆二色光谱法对复性前后rhDll1的构象分析,以上结果表明,不同配基的四种固定相均可放大规模实现rhDll1包涵体复性与同时纯化,可分别获得浓度为0.11 mg/mL(苯乙胺)、0.11 mg/mL(苯丙胺)、0.19 mg/mL(色氨酸)、0.08 mg/mL(胆酸)的 rhDll1。