研究背景和目的：前列腺癌在欧美是影响老年男性健康最常见的实体肿瘤,是男性肿瘤致死的常见原因。前列腺癌是临床上常见的一种异质性、多灶性肿瘤。虽然前列腺癌发病主要局限于前列腺,但是它具有多种不同行为的类型。其中一些类型呈现惰性行为,但具有不良的临床预后。因此,前列腺癌对公众健康构成挑战。近年来,随着前列腺特异性抗原的筛选普及,越来越多进展缓慢的前列腺癌被检测出。即使在诊断及辅助治疗取得成绩,前列腺癌患者的临床预后并没有显著改善。越来越多的临床病理资料用来判断前列腺癌患者的预后,比如Gleason评分、术前PSA水平及病理分期。但是许多研究表明,患者即使有相似的PSA水平、Gleason评分及病理分期,它们有不同临床结局。这说明前列腺癌的发生是多阶段过程,并具有影响肿瘤进展及预后的不同发病机制。因此,有必要寻找新的诊断及治疗靶标,以此来了解前列腺癌的发病进程、提高治疗效率及改进患者的临床预后。许多研究表明,miRNAs在许多肿瘤的发病进程中起着重要作用。miRNAs是一种短片段、非编码RNAs,通过部分或全部结合mRNA的3-UTR,导致mRNA降解或抑制转录,而调控靶基因的表达水平。miRNAs及靶基因mRNAs不完全的碱基配对参与许多重要的细胞进程,如细胞增殖、分化、凋亡及细胞周期等。近期研究还证实miRNAs在许多病理通路起着关键作用,如宿主-病毒间相互作用及肿瘤发生等过程。从功能上而言,miRNAs可起着致癌基因或抑癌基因作用。同其他肿瘤相似,前列腺癌具有特异的miRNA表达谱。2011年,我们研究团队曾经对前列腺癌的miRNAs表达谱进行研究。我们发现11个上调的miRNA及17个下调的miRNA.其中我们发现miR-224在前列腺癌是显著下调的,而miR-224在其他肿瘤可调控细胞增殖、凋亡,参与肿瘤发生的进程。我们的另一项研究也证实,miR-224的下调表达提示前列腺癌患者的不良临床预后,并在细胞学水平它可通过下调TRIB1而抑制前列腺癌的发病进程。由于一种miRNA可同时靶向调控多种基因,我们认为miR-224的潜在调控机制尚不清楚。因此,我们采取一系列实验探索miR-224-靶基因轴是否参与前列腺癌发生及进展的机制。材料：前列腺癌细胞DU145从美国ATCC公司购买(Manassas, VA, USA),细胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基,2mM L-谷氨酸,及抗生素。正常前列腺上皮细胞(PREC)从Lonza公司购买,培养于含抗生素的PrEGM Bullet kit。所有细胞均在37摄氏度、5%CO2、湿润的环境培养。本研究由广州医科大学附属广州市第一人民医院伦理委员会批准,病人均签署知情同意书。所有组织样本的处理均符合伦理及法律法规。miRNA芯片及荧光定量PCR分析,采用4对和20对前列腺癌组织及癌旁正常组织,这些组织从广州医科大学组织样本库获取。TURP或耻骨上前列腺摘除术,样本切除后,迅速投放于液氮中,用于RNA的提取。术前患者均未接受放疗或化疗。术中均冰冻检测组织病理类型,术后石蜡样本再次证实组织属性。Taylor数据库用于生存分析,其包含149例原发性前列腺癌样本及29例癌旁良性组织样本,数据库含miRNAs及mRNAs的资料。方法：2种靶基因预测软件miRWalk (最后更新版本2013年3月15日)、miRanda(最后更新版本2010年11月),用来预测miR-224的靶基因。基因芯片分析如我们前述文章。数据上传于GEO数据储存库(http://www.ncbi.nlm.nih.gob/geo/, accession number GSE34932)。miRNAs从20对前列腺癌及癌旁良性组织提取,所用试剂盒为百泰克miRNA提取试剂盒。miRNA基因表达水平采用All-in-one miRNA qRT-PCR检测试剂盒(GeneCopoeia)。 RNU6B作为内参基因。PCR扩增的特异性采用溶解曲线分析及凝胶电泳确认。Ct值分析目标miRNA的相对表达水平。均数±标准差表示miRNA的表达水平。miR-224编码序列克隆于p MIRNA1腺病毒载体(SBI, USA)以表达miR-224前体。发夹p CDH-CMV-MCS-EF1-copGFP作为阴性对照。P PACKH1质粒包装后miR-224/miR-NC转染293TN细胞,病毒包装试剂盒(CatNo:LV500A-1, SBI, USA)。3天后,病毒颗粒按说明书收集,腺病毒沉淀收集试剂盒(CatNo:LV810A, SBI, USA).病毒转染DU145前列腺癌细胞株(所用试剂盒CatNo:LV85OA-1, SBI,USA)。细胞计数器计一定数量的细胞,种植于96孔板。Si-CAMKK2及si-NC寡核苷酸购于上海吉玛公司。CAMKK2编码序列克隆于p GCMV/EGFP/Neo载体(上海吉玛)。空载体作为空白对照。Fugene转染试剂盒(Roche, USA)用来转染siRNA或质粒。Westerb blot检测不同蛋白的表达变化。细胞转染48h后,提取蛋白用于Western blot分析。40ug蛋白加入SDS-PAGE孔槽里,转于Hybond nitrecellulose膜(GE Healhcare)。5%脱脂牛奶封闭,anti-CAMKK2(兔抗,ab96531,稀释倍数1：150,剑桥,英国)或anti-β-actin (兔抗,sc-7210, Santa Cruz Biotechnology, USA)一抗孵育。SuperSignal West PICO荧光显像试剂盒(Pierce Biotechnology)检测蛋白条带大小。β-actin用来做内参对照。荧光素酶报告实验检测CAMKK2是否为miR-224的靶基因。miR-224可能结合CAMKK2,其互补序列3-UTR或变异序列,克隆于p GL3荧光素酶报告载体(Promega, USA)。 DU145前列腺癌细胞培养于24孔板,共转染荧光质粒、10ng miR-224模拟物、NC模拟物及2ng p RL-SV40 RLuci载体(Promega, USA).荧光活力由双荧光报告实验系统检测。相对值由生物荧光检测仪分析(PerkinElemer, USA)。对于细胞活力的检测,2×103个细胞培植于96孔板,培养24、48及72h后,细胞由20u1的CCK8溶液孵育4小时(Cat No:C0038, Beyotime, China)。酶标仪检测495nm波长的吸光值。均数±标准差表示细胞活力的相对表达水平。对于细胞周期的检测,10厘米培养皿的细胞收集,70%乙醇固定,40摄氏度下过夜。染色前,重新收集细胞、PBS重新静置,propidium Iodide(PI)溶液染色细胞,37摄氏度下孵育15分钟。流式细胞仪获取数据(BD FACSVerse TM System, BD Biosciences),软件分析数据(BD FACSuite TM software)。均数±标准差表示细胞活力的相对表达水平。细胞侵袭实验检测前列腺癌细胞的侵袭力。Transwell孔加入50ul的无血清RPMI1640培养基及Matrigel (1:10; BD Bioscience, USA)。 Transwell孔置于24孔培养板(Transwell, Corning, USA),其中含10%胎牛血清培养基。37摄氏度下孵育4小时,固定后,5×104细胞置于上室。在37摄氏度及5%CO2环境下孵育48小时,丝裂霉素停止细胞的有丝分裂,10%福尔马林固定膜,0.05%Crystal Violet染色。计数穿过孔的细胞。均数±标准差表示细胞侵袭的相对水平。划痕实验检测细胞的转移力。当细胞达到一定数量时,pipette tip划一道痕。含丝裂霉素的培养基常规培养48小时后,新鲜培养基清洗培养皿2次,移除漂浮的细胞,并拍照。计数从细胞痕爬出的细胞数目。实验重复3次。均数±标准差表示细胞侵袭的相对水平。统计学处理：所有实验数据均用均数±标准差表示,数据统计用SPSS17.0统计软件包处理。多组连续变量数据的比较,采用Two-way ANOVA分析各组的表达差异,两两比较采用Bonferroni法,包括荧光素酶报告实验、细胞周期、细胞侵袭及细胞转移实验；细胞增殖实验的数据比较采用析因设计的方差分析：前列腺癌组织miR-224及CAMKK2的表达情况分析,采用Spearman相关分析。卡方检验分析它们在前列腺癌组织中的miR-224/CAMKK2表达与前列腺癌患者临床病理参数之间的关系。从年龄、PSA水平、Gleason评分、临床分期、病理分级等相关方面,采用logistic回归分析筛选miR-224及CAMKK2协同表达的危险因素。其他两组均数的比较采用独立样本的t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。结果：1. CAMKK2是前列腺癌miR-224的靶基因我们过去研究证实前列腺癌miR-224起着抑癌作用。为了进一步阐明miR-224的调控机制,miRNA靶基因预测软件(miRWalk及miRanda)用来预测miR-224的潜在靶基因。两种软件均预测到CAMKK2是miR-224的潜在靶基因。我们设计一系列实验,运用hes-miR-224过表达质粒转染DU145细胞,miR-224的表达水平显著高于阴性对照组(1.00±0.20 vs.5.11±1.10,t=-6.367,P=0.003)。Western blot结果表明miR-224过表达后CAMKK2蛋白的表达是显著下调的(相对表达值：0.42±0.09 vs. 0.13±0.05,t=4.879,P=0.008)。我们进而运用荧光素酶报告实验阐明CAMKK2是否为miR-224的靶基因。对miR-224和CAMKK2的野生型结合位点进行定点突变。miR-224过表达质粒和野生型CAMKK2共转染组的DU145细胞荧光素酶活性下降约50%(F=13.47,P=0.002),而突变型转染组中荧光素酶活性无明显变化,统计分析显示差异无统计学意义(P=1.000)。结果表明,miR-224可互补结合CAMKK2 mRNA的3-UTR位点,即CAMKK2是miR-224的靶基因。2.miR-224通过靶向负调控CAMKK2抑制前列腺癌细胞增殖我们之前的研究发现miR-224过表达可抑制前列腺癌DU145细胞的增殖、细胞周期、侵袭及转移。我们进一步确认miR-224是否通过调控CAMKK2表达而起着相应的细胞调控作用。我们将miR-224、CAMKK2载体、si-CAMKK2转染前列腺癌细胞DU145后,western blot验证CAMKK2的表达情况。结果所示,CAMKK2过表达后能够逆转miR-224对CAMKK2蛋白的抑制作用(F=16.88,P=0.001)。首先,我们验证CAMKK2过表达能够逆转miR-224对前列腺癌细胞增殖抑制的作用。实验发现转染不同质粒72h, CAMKK2过表达后使miR-224转染的DU145细胞生长速度显著加快(F=158.62,P<0.001)。结果表明,CAMKK2过表达可消除miR-224对前列腺癌细胞增殖的抑制效应。细胞周期实验的结果发现,转染72h后,CAMKK2过表达显著逆转了miR-224对G1期的阻滞,细胞周期分布接近于对照细胞,即CAMKK2通过增加S+G2/M周期而促进细胞增殖(P<0.001)。但是,Transwell侵袭实验及划痕转移实验表明,CAMKK2不能逆转miR-224对前列腺癌细胞的侵袭及转移力的抑制作用(P>0.05)。这说明CAMKK2对细胞侵袭及转移无明显作用。因此,我们结果表明,miR-224可部分通过靶向调控CAMKK2而抑制前列腺癌细胞增殖及细胞周期。3.前列腺癌miR-224及CAMKK2表达显著负相关QRT-PCR检测20对原发性前列腺癌miR-224及CAMKK2的表达情况。研究表明,miR-224在前列腺癌中下调表达,CAMKK2是上调表达的。那么前列腺癌组织miR-224及CAMKK2是否存在负相关关系呢?我们结果表明,miR-224下调表达同CAMKK2的上调表达呈显著负相关关系(r=-0.657,P=0.002)。这结果同Taylor数据库的结果一致(r=-0.423,P<0.001)。4.miR-224及CAMKK2共表达同前列腺癌临床病理特征相关根据miR-224及CAMKK2表达水平的中位数分组,分为miR-224高-低表达组及CAMKK2高-低表达组。在104例患者中,38例(36.54%)miR-224低表达及CAMKK2高表达(miR-224 low/CAMKK2 high),14例(13.46%)miR-224高表达及CAMKK2低表达(miR-224 high/CAMKK2 high),其他52例(50.0%)患者两者均高表达或均低表达(miR-224 low/CAMKK2-low; miR-224 high/ CAMKK2-high)。我们进而研究miR-224及CAMKK2协同表达同前列腺癌临床病理参数的关系。结果表明(Table 3.6), miR-224低/CAMKK2高表达(miR-224 low/CAMKK2 high)同前列腺癌进展性临床分期显著相关(P=0.028)。miR-224/CAMKK2的表达量同年龄(P=0.499)、PSA水平(P=0.645)、Gleason评分(P=0.865)、转移(P=0.652)及生化复发(P=0.412)无显著相关。这说明,miR-224及CAMKK2协同表达同前列腺癌的临床发病进程是密切相关的。5.miR-224及CAMKK2共表达同前列腺癌患者预后密切相关运用Taylor数据库及Kaplan-Meier方法,我们检测miR-224及CAMKK2共表达同前列腺癌的总体生存率的关系。同miR-224及CAMKK2其它表达组别相比,miR-224低/CAMKK2高表达的患者总体生存率是显著降低的(P=0.028)。多因素回归分析模型还证实miR-224低/CAMKK2高表达、Gleason评分时前列腺癌总体生存率的独立预后因素。结论：1.CAMKK2是前列腺癌miR-224的靶基因。2.miR-224通过靶向负调控CAMKK2抑制前列腺癌细胞周期及增殖。3.miR-224及CAMKK2表达协同参与前列腺癌的发病进程。4.miR-224及CAMKK2表达协同预测前列腺癌的临床预后。