论文部分内容阅读
本论文主要研究金线莲多糖对酒精诱导的小鼠肝损伤的保护作用以及金线莲多糖颗粒冲剂的研制。水提醇沉法提取金线莲中的多糖,运用HSCCC法纯化金线莲粗多糖,然后应用膜透析脱盐进一步纯化,得金线莲纯多糖（ARPS）并对ARPS进行结构表征,研究金线莲粗多糖和金线莲纯多糖对酒精诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用,采用湿法制粒工艺,制备金线莲多糖保肝颗粒冲剂,为金线莲的进一步临床研究与开发,剂型的制备提供理论依据。本实验分为四个部分:1.金线莲多糖的分离纯化采用水提醇沉法提取金线莲中的多糖,提取条件:称取金线莲粉末若干克,料液比1:20加入双蒸水,60℃超声提取30 min,4200 r/min离心15 min,取上清液,重复提2次,合并三次提取液旋转蒸发浓缩至小体积后Sevage法除蛋白,加入3倍体积的无水乙醇醇沉,4℃过夜沉淀,离心收集沉淀物,冷冻干燥至恒重得金线莲粗多糖。建立高速逆流色谱法纯化金线莲多糖（ARPS）纯化工艺,然后用膜透析进一步脱盐纯化。HSCCC的条件为:双水相体系为12.5%PEG1000-20%磷酸氢钾（pH=6.8）,转速为850 r/min,上相（流动相）的流速为1.0 mL/min。5%苯酚-硫酸法跟踪检测,合并相同组分,低压旋转蒸发浓缩至小体积,用M12000截留分子量的膜进一步透析脱盐纯化,采用钼酸铵检测透析液中磷酸盐是否透析完全,合并透析袋内的组分,旋转蒸发浓缩,冷冻干燥,即得金线莲纯多糖。2.金线莲多糖的结构表征及其组成分析通过UV、HPLC、LC-MS、IR、NMR、AFM、碘-碘化钾及刚果红实验等方法展开对ARPS的结构表征以及组成分析。结果表明ARPS分子量为22090 Da,主要由甘露糖、核糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成,且各单糖的摩尔比为:甘露糖:核糖:葡萄糖:半乳糖:阿拉伯糖=1.00:8.47:47.30:1.17:1.19。糖苷键为α构型,不存在三股螺旋构象,且AFM镜下观察显示其分子聚集紧密成团,类似球状,直径约为120380 nm。3.金线莲粗多糖和纯多糖对小鼠酒精肝的保护作用研究金线莲粗多糖对小鼠酒精肝的保护作用实验中,我们将昆明种小鼠分为空白组、模型组、金线莲粗多糖组,金线莲粗多糖高中低剂量保护组,香菇多糖阳性对照组,用50%乙醇（12 mL/kg）连续9 d灌胃小鼠,从而造成急性酒精性肝损伤动物模型。末次灌胃12 h后禁食不禁水,称取各组小鼠体重,眼球取血,12000r/min离心10 min取上清液,测定血清中ALT,AST水平以及TG的含量;然后处死小鼠立刻取出肝脏,称取各组小鼠肝脏重量,计算肝脏指数,然后将解刨出的部分肝脏制备10%肝脏匀浆,按照试剂盒的要求测定肝脏中GSH、SOD、MDA、H2O2、TNF-α和NO的含量和NOS的活性,剩余部分肝脏做HE染色实验。实验结果表明,金线莲粗多糖各剂量保护组均可降低血清中ALT,AST水平以及降低TG的含量,升高肝脏中GSH和SOD的含量,降低MDA、H2O2、TNF-α和NO的含量,降低NOS的活性（P<0.05）,HE染色实验表明和模型组相比金线莲纯多糖各剂量组均有不同程度的改善空泡现象,未见炎症细胞侵润现象,金线莲粗多糖对酒精诱导的小鼠急性肝损伤具有保护作用。基于金线莲粗多糖对小鼠酒精肝的保护作用实验的基础上,开展金线莲纯多糖对小鼠酒精肝的保护作用实验,将昆明种小鼠分为空白组、模型组、金线莲纯多糖高低剂量保护组,香菇多糖阳性对照组,其他实验步骤和保肝作用的检测指标同金线莲粗多糖对小鼠酒精肝的保护作用实验,结果表明金线莲纯多糖对酒精诱导的小鼠急性肝损伤具有保护作用。4.金线莲多糖保肝颗粒冲剂的研制选用合适得辅料,以成型率为指标,优选75%乙醇为润湿剂,从吸湿性,休止角以及成型率综合评价,最后优化得金线莲多糖颗粒的制备工艺:金线莲粗多糖:可溶性淀粉:乳糖=5%:71.25%:23.75%,75%乙醇为润湿剂,制备软才,“手握成团,轻敲即散”,20目筛制粒,60℃烘箱烘粒4 h。每袋金线莲颗粒10g（含金线莲多糖0.28 g）。