目的：心肌梗死(Myocardial infarction, MI)后行成肌细胞(skeletal myoblasts, SKMs)心肌内移植可有效改善心脏收缩功能,但移植后恶性心律失常的发生率明显增高。研究发现SKMs移植后在体内可以分化成为成熟的骨骼肌样细胞,与心肌细胞不能形成功能性缝隙连接,而在体外培养的未分化的SKMs可与心肌细胞形成有效电偶联。研究显示MI后心室重塑影响移植后细胞的分化和增殖。故考虑SKMs移植的致心律失常作用可能与其分化状态有关,改善心室重塑改善移植后细胞的微环境可以减少移植后心律失常的发生。微小RNA-181(microRNA-181, miRNA-181)通过抑制同源盒蛋白All (Homeobox-All, Hox-All)的表达促进SKMs分化成熟。本研究拟构建重组慢病毒载体,敲除miRNA-181,抑制成肌细胞的分化。观察分化状态对SKMs的影响,将抑制分化了的SKMs移植到缺血心肌内,研究对心功能和心律失常的影响；进一步通过缬沙坦改善心室重构,研究心肌局部微环境对移植后SKMs的分化以及心律失常的影响。方法：1、对比研究两种不同SKMs培养方法,筛选构建高效的SKMs培养体系。2、设计构建针对miRNA-181的小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)慢病毒表达载体Lenti-siR-miR181,转染体外培养的原代SKMs(慢病毒转染组,Tr组),用抗萤光素酶的慢病毒载体(Lenti-siLUc)作为阴性对照(Negative controlgroup, Nc组),以等体积的PBS设为对照组(Control Group, Cn组)转染SKMs。转染后1、3、5、7天分别提取全细胞蛋白、总RNA,通过qRT-PCR检测miRNA-181水平,Western blot检测Hox-All蛋白,Real-Time PCR检测病毒转染后各时间点Hox-All mRNA水平,以鉴定此重组慢病毒载体的有效性。3、以此有效病毒载体转染SKMs,用甲基噻唑基四唑。(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)及流式细胞仪检测对SKMs增殖能力影响。实时定量PCR(Real-Time PCR)检测转染后7天SKMS缝隙连接蛋白(Connexion-43, Cx43) mRNA水平的变化,免疫荧光检测SKMs Cx43蛋白的表达情况。将SKMs与心肌细胞共同培养,膜片钳检测SKMs对心肌细胞动作电位的影响。免疫荧光法检测体外诱导分化培养的SKMs中快反应肌球蛋白重链(Fast Myosin Heavy Chains, F-MHC)表达,研究miRNA-181敲除对体外培养SKMs分化的影响。4、冠状动脉结扎制造大鼠心肌梗死模型(n=150),术后1周超声检测心功能,随机分为3组,梗死心肌边缘注射移植100μL(共5×106个细胞)细胞悬液(MI-KO组),用转染Lenti-siLUc的SKMs作为阴性对照(MI-SKM),对照组仅注射100μL PBS (MI-Cn组)。在细胞移植后2周、1月,分别用超声学方法检测心功能,在体电生理检查,程序性电刺激检测各组室性心动过速的诱出率。ELASA检测各组血清氨基末端脑钠肽(N -Terminal Pro- Brain Natriuretic Peptide,NT -ProBNP)水平,免疫组织化学检测心肌内移植细胞Hox-All和Cx43的表达情况。5、SKMs移植后缬沙坦(20mg/Kg·D-1)干预以改善心肌重塑,在干预后2周、1月再次进行电生理检查,研究对心律失常的影响,免疫组化法观察梗死边缘区心肌胶原表达情况,Western Blot检测Cx43表达变化,血管密度等对心肌微环境的影响,研究心肌微环境变化对SKMS移植后心律失常的影响。结果：1、两种方法获得的细胞在纯度(91.5±4.1% vs.85.3±5.3%,P=0.062)和细胞存活度上(90.7±2.9%vs.94±6.1%,P=0.058)没有统计学差异,但组织块法细胞纯度相对较低。2、针对miRNA-181的重组慢病毒载体Lenti-siR-miR181,可以高效转染SKMs(转染效率最高为82.5%)。转染后3、5、7天,慢病毒转染组(Tr组)的miRNA-181水平较对照组(Cn组)和阴性对照组(Nc组)明显降低(在各时间点,miRNA-181水平分别为对照组(Cn组)。的60±6.5%,35±3.2%和30±2.4%, P<0.05)o Hox-All蛋白水平与转染后1天相比明显降低(Day3：0.42019±0.0231 vs.0.6911±0.0712,P<0.001), (Day5：0.2157±0.0107 vs.0.6911±0.0712,P<0.001),(Day7：0.0880±0.0211 vs.0.6911±0.0712,P<0.001)。Tr组第5、7天明显高于对照组(Cn组)(Day 5：0.3807±0.0317 vs.0.1803±0.050,P<0.001；Day 7：0.2981±0.0178 vs. 0.2010±0.0319,P<0.001).)而各时间点Hox-All mRNA水平无明显差异(p=0.071))。3、MTT结果显示：Tr组SKMs的增殖在转染后第3天与Nc组无明显差异,但在第7天增殖明显高于Nc组和Cn组(OD值为Day7：0.91968±0.063 vs.0.8206±0.072 vs.0.6302±0.059,P<0.05,P<0.05)。Tr组转染后7天Cx43蛋白表达明显高于Cn组(0.94±0.07 vs.0.63±0.09,P<0.05)。分化培养后7天,敲除miRNA-181的SKMS内F-MHC表达明显低于Cn组。4、细胞移植后2周MI-KO组和MI-SKM组大鼠LVEF明显高于MI-Cn组,(MI-KO vs. MI-Cn:42.05±3.16% vs.34.17±1.99%, P<0.05; MI-SKM vs. MI-Cn:41.98±3.7% vs.34.17±2.09%,P<0.05),细胞移植组与移植前相比明显改善(MI-KO:42.05±3.16% vs.34.17±2.09%,P<0.05; MI-SKM 41.91±2.7% vs.35.1±2.8%,P<0.05),这种心功能的改善可持续到移植后1个月。移植后SKM移植组,室速的诱出率高达71%,明显高于MI-Cn组(P<0.01)。在MI-KO组,其室速的诱出率为34%,明显低于MI-SKM组(P<0.01),但与MI-Cn组相比没有明显差异(P>0.05)。而在随后的1月时各组间室速的诱出率没有明显的统计学差异(MI-Cn组：31%,MI-KO:28%, MI-SKM:66%, P=0.062)。5、缬沙坦干预2周后,MI-KO组,MI-KO+V组,MI-SKM组，MI-SKM+V组的LVEF明显高于对照组(MI-Cn)(移植后14天可见,MI-KO vs. MI-Cn: 41.05±3.1%vs.33.9±2.0%,P<0.05; MI-KO+V vs.MI-Cn:42.5±2.4%vs.33.9±2.0%; MI-SKM vs.MI-Cn:41.91±2.7%vs.33.9±2.0%, P<0.05; MI-SKM+V vs.MI-Cn:42.6±2.0% vs.33.9±2.0%,P<0.05。移植后1个月MI-KO vs. MI-Cn:40.35±2.3%vs. 34.5±2.5%, P<0.05; MI-KO+Vvs. MI-Cn:44.1±3.0% vs.34.5±2.5%。; MI-SKM vs.MI-Cn:41.6±2.7% vs.34.5±2.5%, P＜0.05; MI-SKM+V vs.MI-Cn:43.9±2.2%vs.34.5±2.5%,P<0.05。移植后一个月可以观察到缬沙坦处理可以使心脏功能进一步改善(MI-KO vs. MI-KO+V:40.35±2.3%vs.44.1±3.0%; MI-SKM vs. MI-SKM+V:41.6±2.7%vs.43.9±2.2%,均P<0.05),而在移植后14天时未见统计学差异。细胞移植后2周缬沙坦处理组(MI-SKM+V组,MI-KO+V组)与相应的未处理对照组(MI-SKM组,MI-KO组)相比,室性心动过速的发生率没有统计学差异,但移植后1月缬沙坦处理组室速发生率为(MI-KO+V 29%,)明显低于未处理组(MI-KO,46%)和对照组(MI-Cn,64%).免疫组化显示缬沙坦处理组梗死边缘区Ⅰ型胶原蛋白较对照组明显降低,血管密度高于对照组(MI-KO+V vs. MI-KO:148.52+34.57 vs.102.31±30.75/mm2,P<0.05), Cx43蛋白表达高于对照组。结论：1、miRNA-181敲除可以促进体外培养的成肌细胞增殖,抑制体外培养的成肌细胞分化。阻止成肌细胞诱导分化时Cx43的降低。2、敲除miRNA-181的SKMs在心肌内分化减缓,但仍可进一步分化成熟,移植后早期心律失常的发生率明显降低,对移植后晚期心律失常无明显改善。3、缬沙坦可以改善心室重塑,改善移植后成肌细胞的增殖,减少移植后心律失常的发生,但对分化无明显影响。