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目的:轮状病毒是引起婴幼儿及多种幼龄动物病毒性腹泻的主要病原,仔猪感染轮状病毒在我国和世界许多养猪国家普遍存在,由于轮状病毒的感染而花费的治疗和预防等费用以及牲畜的死亡,给世界范围内的养猪业造成了重大的经济损失,接种疫苗是防治病毒性感染的主要措施,研究有效的疫苗对轮状病毒防治有着重要意义。方法:首先选择大肠杆菌BL21（DE3）作为原核表达菌株,以p ET32a质粒为表达载体,以猪轮状病毒VP4的部分基因序列为目的片段,构建p ET32a-VP4重组表达载体,从而获得p ET32a-VP4-DE3原核表达系统。其次通过诱导p ET32a-VP4-DE3菌表达目的蛋白,然后进行纯化浓缩,获得足量的目的蛋白VP4。最后以VP4蛋白为抗原免疫实验动物仔猪,通过检测诱导的相关抗体水平,进而分析VP4蛋白的免疫原性。1.根据文献报道的PRV VP4基因主要的抗原位点,通过查阅NCBI的基因库,获得VP4基因序列（Accession No.AY523636）,以其VP4主要抗原位点基因片段为目的基因,分别将其与表达载体p ET32a用HindⅢ酶和XbaⅠ酶双酶切,然后以T4 DNA连接酶连接,获得重组表达载体,而后进行质粒测序鉴定、酶切鉴定以及菌体抗性筛选等一系列实验的验证,鉴定出连接正确的重组表达载体p ET32a-VP4,再转化DE3感受态细胞获得p ET32a-VP4-DE3原核表达系统。2.在活化培养后的菌液加入诱导剂,摇床培养,诱导目的蛋白的表达。收集诱导后的菌体沉淀,进行液氮冻融,超声破碎,将超声后的菌液在12000 r/min,4℃的条件下离心收集沉淀,用8 M尿素溶液溶解沉淀,然后将其用0.45μm的滤膜进行过滤,按照纯化的步骤进行上柱纯化,纯化后的VP4蛋白盛于透析带并按照一定浓度梯度的尿素进行复性,然后用蔗糖浓缩,用酶标仪测其浓度。3.实验前设计合适的抗原蛋白免疫剂量,在乳化仪下将VP4蛋白及佐剂共同乳化,用经检测合格的乳化剂免疫仔猪。对照组用PBS免疫,实验组用乳化剂肌肉注射免疫,30d和49 d后进行口服加强免疫。在初次免疫以后的每一周采集仔猪的血液、粪便和唾液样品,ELISA法检测血清中特异性抗体Ig G水平,血清中细胞因子IFN-γ和IL-4水平,粪便和唾液样品中特异性抗体IgA水平。结果:1.双酶切的方法重组质粒p ET32a-VP4和空载体p ET32a进行鉴定,电泳结果说明,重组质粒p ET32a-VP4经双酶切后,在Marker 1000 bp的下部,有明亮条带,与目的片段792 bp相符合,然后经过测序鉴定,重组质粒p ET32a-VP4构建无误。2.诱导表达后的菌体经过冻融、超声破碎后分离上清和沉淀,经过聚丙烯酰胺凝胶电泳的鉴定,电泳结果说明目的蛋白VP4成功表达且蛋白表达在包涵体中,然后过经亲和柱纯化收集后,得到了大量的目标蛋白,并且纯化效果良好,没有发现杂蛋白。3.用ELISA方法检测所有血清样品中特异性Ig G抗体。实验结果说明,经VP4蛋白诱导仔猪血清中产生了特异性Ig G抗体,在首免14 d后,仔猪血清中Ig G抗体水平要明显比对照组高,两次口服加强免疫后血清中特异性Ig G抗体水平有不同程度的升高,而且其水平显著高于对照组水平;ELISA实验检测仔猪粪便和唾液中特异性IgA抗体。三次免疫后,仔猪粪便和唾液中产生了特异性IgA抗体,而且实验动物组特异性IgA抗体水平要显著高于对照组,对照组OD450值维持在较低水平且变化不大;首免49 d后实验组仔猪血清中细胞因子IFN-γ和IL-4的水平较对照组高,说明VP4可以诱导仔猪细胞免疫应答反应。在首免49 d后呈现不断降低的趋势,在77 d后实验组的IFN-γ水平依然较对照组高。另外,在首免84 d后实验组的IL-4水平也要高于对照组水平,这说明血清中诱导产生IFN-γ和IL-4后可以维持较长时间。结论:1.本实验构建了重组pET32a-VP4载体,获得了p ET32a-VP4-DE3重组菌株。成功诱导重组菌表达目的蛋白VP4,并经亲和柱纯化后获得大量的VP4蛋白,并测得其纯化浓缩后的浓度为3.34 mg/m L。2.以VP4蛋白为抗原免疫仔猪,检测结果显示,VP4可以诱导仔猪机体高水平的血清Ig G特异性抗体和细胞因子IFN-γ和IL-4,另外,在唾液和粪便样品中也可检测出较高水平的IgA特异性抗体,说明VP4蛋白具有良好的免疫原性,可以诱导仔猪产生全身免疫应答反应,同时也可以产生肠道的局部粘膜免疫应答反应。