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鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis，IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus，IBV)感染引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。由于IBV基因组易发生变异和重组，IBV的基因型和血清型复杂多样，且不同血清型间交叉保护性效果不理想。新基因型甚至新血清型不断出现，给IBV的有效防控带来了巨大困难。本研究从疑似IBV感染的IBV免疫鸡群分离鉴定出2株IBV，并对其全基因组进了测序分析以及克隆表达了S1基因。为进一步了解丰富国内IBV流行株的重组变异情况，潜在的免疫逃逸机制以及疫苗毒株筛选依据等积累了数据。
1、两株鸡传染性支气管炎病毒的分离与鉴定
本研究首先从疑似IBV感染的IBV免疫鸡群采集发病鸡脏器进行鸡胚接种病毒分离。5天后发现接种两个肾脏样品的鸡胚出现典型的卷曲侏儒胚。但其尿囊液不具有血凝现象，以尿囊液提取的RNA反转录的cDNA为模版。用IBV的S基因特异性引物进行了PCR扩增鉴定，PCR扩增以及序列测序表明能从两个尿囊液样品中扩增出IBV的S基因特异性片段，同时将分离到的这两个毒株分别命名为IBV34以及IBV216。应用DNAStar分析软件的ClustalW将克隆到的IBV34以及IBV216毒株S1基因分别与Gen Bank中国内外IBV参考毒株的S1基因进行序列比较和同源性分析发现IBV34以及IBV216毒株均属于QX型IBV。IBV34以及IBV216毒株的S1基因与QX型的LX4毒株同源性分别高达95.5％以及95.4％。值得注意的是，与IBV34毒株以及Gen Bank中其它国内外IBV的S1基因不同，IBV216毒株的S1基因缺了12个碱基。从IBV免疫鸡群分离鉴定出的IBV34以及IBV216毒株对进一步探究IBV免疫逃逸机制提供了材料。
2、两株鸡传染性支气管炎病毒的全基因组测序与分析
为进一步分析从从IBV免疫鸡群分离鉴定出的IBV34以及IBV216毒株可能存在的变异以及重组现象。本研究利用21对引物，通过PCR扩增，TA克隆以及序列测序对分离株IBV34及IBV216的全基因组进行了解析。结果发现分离株IBV34以及IBV216全基因组全长分别为27647bp与27654bp（不包括5端帽子和3端polyA尾巴）。基因组结构符合IBV的基因组基本特征。IBV34以及IBV216毒株的全基因组序列与QX型的YX10毒株的全基因组序列同源性分别高达96.6％以及96.7％。重组事件分析进一步发现，IBV34毒株基因组中鉴定出2个重组事件。分别位于IBV34基因组5567-8121片段、8672-11925片段。IBV216毒株基因组中同样鉴定出2个重组事件。分别位于5564-7886片段、8402-11923片段。重组来源分析显示IBV34和IBV216来源于QX型与TC07-2型基因型IBV重组。
3、两株鸡传染性支气管炎病毒S1基因的克隆
为进一步探究这两株来自IBV免疫鸡群的IBV毒株的S1蛋白的抗原性。本研究将IBV34以及IBV216毒株的S1基因分别克隆至线性化载体pGEX-6p-1和pcDNA3.1上。成功构建了S1原核表达载体pGEX-6P-1-IBV34-S1、pGEX-6P-1-IBV216-S1及真核表达载体pcDNA3.1-IBV34-S1、pcDNA3.1-IBV216-S1。将重组子pGEX-6P-1-IBV34-S1、pGEX-6P-1-IBV216-S1分别转化至BL-21感受态中。经IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析发现GST-S1蛋白不仅可以以包涵体形式表达，而且还可以以可溶性形式表达。利用抗QX型IBV血清对真核表达载体pcDNA3.1-IBV34-S1以及pcDNA3.1-IBV216-S1的表达进行了验证。结果发现，所用的抗QX型IBV血清能很好的识别转染pcDNA3.1-IBV34-S1的LMH细胞。可见亮绿色荧光;而在转染pcDNA3.1-IBV216-S1的LMH细胞以及转染对照载体pcDNA3.1的DF-1细胞中未见亮绿色特异性荧光。这一结果提示IBV216毒株S1蛋白中缺失的4个氨基酸(62-65aa)可能影响S1蛋白的抗原性以及血清的免疫反应性。
1、两株鸡传染性支气管炎病毒的分离与鉴定
本研究首先从疑似IBV感染的IBV免疫鸡群采集发病鸡脏器进行鸡胚接种病毒分离。5天后发现接种两个肾脏样品的鸡胚出现典型的卷曲侏儒胚。但其尿囊液不具有血凝现象，以尿囊液提取的RNA反转录的cDNA为模版。用IBV的S基因特异性引物进行了PCR扩增鉴定，PCR扩增以及序列测序表明能从两个尿囊液样品中扩增出IBV的S基因特异性片段，同时将分离到的这两个毒株分别命名为IBV34以及IBV216。应用DNAStar分析软件的ClustalW将克隆到的IBV34以及IBV216毒株S1基因分别与Gen Bank中国内外IBV参考毒株的S1基因进行序列比较和同源性分析发现IBV34以及IBV216毒株均属于QX型IBV。IBV34以及IBV216毒株的S1基因与QX型的LX4毒株同源性分别高达95.5％以及95.4％。值得注意的是，与IBV34毒株以及Gen Bank中其它国内外IBV的S1基因不同，IBV216毒株的S1基因缺了12个碱基。从IBV免疫鸡群分离鉴定出的IBV34以及IBV216毒株对进一步探究IBV免疫逃逸机制提供了材料。
2、两株鸡传染性支气管炎病毒的全基因组测序与分析
为进一步分析从从IBV免疫鸡群分离鉴定出的IBV34以及IBV216毒株可能存在的变异以及重组现象。本研究利用21对引物，通过PCR扩增，TA克隆以及序列测序对分离株IBV34及IBV216的全基因组进行了解析。结果发现分离株IBV34以及IBV216全基因组全长分别为27647bp与27654bp（不包括5端帽子和3端polyA尾巴）。基因组结构符合IBV的基因组基本特征。IBV34以及IBV216毒株的全基因组序列与QX型的YX10毒株的全基因组序列同源性分别高达96.6％以及96.7％。重组事件分析进一步发现，IBV34毒株基因组中鉴定出2个重组事件。分别位于IBV34基因组5567-8121片段、8672-11925片段。IBV216毒株基因组中同样鉴定出2个重组事件。分别位于5564-7886片段、8402-11923片段。重组来源分析显示IBV34和IBV216来源于QX型与TC07-2型基因型IBV重组。
3、两株鸡传染性支气管炎病毒S1基因的克隆
为进一步探究这两株来自IBV免疫鸡群的IBV毒株的S1蛋白的抗原性。本研究将IBV34以及IBV216毒株的S1基因分别克隆至线性化载体pGEX-6p-1和pcDNA3.1上。成功构建了S1原核表达载体pGEX-6P-1-IBV34-S1、pGEX-6P-1-IBV216-S1及真核表达载体pcDNA3.1-IBV34-S1、pcDNA3.1-IBV216-S1。将重组子pGEX-6P-1-IBV34-S1、pGEX-6P-1-IBV216-S1分别转化至BL-21感受态中。经IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析发现GST-S1蛋白不仅可以以包涵体形式表达，而且还可以以可溶性形式表达。利用抗QX型IBV血清对真核表达载体pcDNA3.1-IBV34-S1以及pcDNA3.1-IBV216-S1的表达进行了验证。结果发现，所用的抗QX型IBV血清能很好的识别转染pcDNA3.1-IBV34-S1的LMH细胞。可见亮绿色荧光;而在转染pcDNA3.1-IBV216-S1的LMH细胞以及转染对照载体pcDNA3.1的DF-1细胞中未见亮绿色特异性荧光。这一结果提示IBV216毒株S1蛋白中缺失的4个氨基酸(62-65aa)可能影响S1蛋白的抗原性以及血清的免疫反应性。