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目的和意义人白血病细胞系已成为白血病及其它肿瘤研究中最常用的工具之一。但建立白血病细胞系是一项难度和偶然性都非常大的工作，国内虽曾有人白血病细胞系建系的报道，但仅有部分能持续传代，且多未能全面鉴定细胞系的细胞遗传学、分子遗传学及其它生物学特性，其中部分细胞尚不能排除系EB病毒永生化的淋巴母细胞系(EBV~+B-LCL)的可能性。目前国内在白血病及相关研究中广泛采用的白血病细胞系几乎均来自国外实验室。本研究拟通过对急性髓性白血病(AML)患者原代白血病细胞的体外培养，建立有特异性染色体异常的AML细胞系，并对其生物学特性进行较为全面的鉴定，为白血病或其它肿瘤研究提供一个有价值的研究工具。方法在本研究中，我们共对300多例急性白血病患者的白血病细胞进行了体外培养，并自1例急性单核细胞白血病(AML-M5b)患者的骨髓建立了国内第1个人单核细胞白血病细胞系SHI-1。在论文的第一部分，我们首先对最终建系成功的AML-M5b患者进行了深入的遗传学研究：以常规R显带法进行核型分析；全染色体涂抹检测6号和11号染色体易位；FISH检测MLL基因重排和p53基因缺失；逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)检测MLL-AF6融合基因的转录本；PCR扩增p53基因的5、6、7和8号外显子，测序分析其有无突变。在第二部分中，我们对SHI-1的建系过程进行了较为详细的阐述，并对其基本生物学特征进行了鉴定：倒置显微镜下观察活细胞生长特征；瑞氏染色后于镜下观察细胞形态；电子显微镜下观察细胞超微结构；α-醋酸萘酚酯酶染色+氟化钠抑制试验、过氧化物酶(POX)染色和α-丁酸萘酚酯酶染色观察其细胞化学染色特点；绘制生长曲线，计算倍增时间；流式细胞仪(FCM)检测SHI-1细胞的免疫表型和细胞周期分布；R显带核型分析动态监测建系过程中SHI-1细胞的染色体改变；RT-PCR检测MLL-AF6融合基因的转录；半固体甲基纤维素集落培养检测SHI-1细胞的集落生成能力；荧光定量PCR检测EB病毒基因组人单孩细胞白血病细胞系S川一l的建立和鉴定中文摘要DNA;DNA荧光染色法(Hoechst 33258)和支原体肉汤培养法检测支原体;明胶酶谱法检测SHI一1细胞无血清培养上清中基质金属蛋白酶一9(MMP一9)和MMP一2的表达;体外穿膜实验观察SHI一1细胞的迁移能力及其机制;全染色体涂抹检测6号和11号染色体易位;FISH检测SH工一1细胞中MLL基因的重排和p53基因的缺失;PCR扩增SHI一1细胞p53基因的5、6、7和8号外显子，测序分析其有无突变;短串联重复序列(STR)一PCR检测SHI一1细胞和患者原代白血病细胞是否来自同一个体;M一FISH检测SH工一1细胞是否存在隐匿性的染色体异常:染色体涂抹验证M一FISH结果;3H一TdR掺入试验检测SHI一1细胞对细胞因子的增殖反应。 在第三部分中，我们对SHI一1细胞的多药耐药谱及其耐药机制进行了研究。内容包括:MTT检测SHI一1细胞的耐药谱;RT-PCR检测SHI一1细胞中多药耐药相关基因一l(MDR一1)、多药耐药相关蛋白(MRP)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)和Bcl一2基因的转录;FCM检测P糖蛋白(P一gP)、M即、肺耐药相关蛋白(LRP)、BCKP、谷胧甘肤一S一转移酶一兀(GST-兀)等耐药蛋白的表达。 在第四部分中，我们对SHI一1细胞在裸小鼠体内的致瘤性进行了研究:将SHI一l细胞接种至4只4周龄NC裸小鼠皮下，观察肿瘤生长情况;取肿瘤组织行常规病理检测;分离瘤组织中单个核细胞(MNC)进行R显带核型分析;Rl’- PCR检测MLL一AF6融合基因的转录;RT-PCR分析SHI一1细胞和瘤组织MNC中血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因的转录。 在第五部分中，我们进行了SHI一1细胞的诱导分化和凋亡的研究:瑞氏染色后光镜下观察三丁酸甘油酷(TB)作用后SHI一1细胞形态学的改变，四哇氮蓝还原试验(NBT)观察TB作用后阳性细胞比例的变化，FCM检测TB作用后CDllb和CD14表达的改变，AnnexinV检测SHI一1细胞的凋亡比例，DNA凝胶电泳观察凋亡梯形条带;瑞氏染色后光镜下观察佛波醋(TPA)对SHI一1细胞的诱导分化作用;瑞氏染色后光镜下观察三氧化二砷(AsZO3)作用后SHI一1细胞形态学改变，AnllexinV检测AsZO:作用后SHI一1细胞的凋亡比例，FCM检测As:O:作用后CDllb和CD14的改变。人单核细胞白血病细胞系SHI一】的建立和鉴定中文摘要结果 (一)患者初诊时核型分析结果提示46，XY，t(6:11)(q27:q23)〔7]/46，XY[2]。患者第1次复发时骨髓细胞核型分析结果提示46，XY，t(6;11)(q27:q23)【8]/46，X丫t(6;11)(q27:q23)，del(17)印11)[8]/46，XY[6]。染色体涂抹结果证实6号和11号染色体之间存在易位。 FISH检测结果显示存在MLL基因的重排。患者第1次复发时的标本经FISH检测显示部分细胞有p53基因的缺失。RT一PCR结果显示该患者检出片段大小分别为535bp和461bp的MLL一AF6融合基因的两种剪切型。p53基因的PCR扩增产物经测序发现5号外显子的第9个编码子存在点突变，由TCC~CCC，相应编码的氨基酸由丝氨酸变为脯氨酸。 (二)SHI一1细胞可在无5637细胞上清或其它细胞因子的条件下持续增殖，适