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类黄酮是积累在大多数植物种子的次生代谢产物,涉及植物的休眠及生存能力等生理功能。类黄酮不仅在花、果实、种子、叶子的着色中起作用,还在植物与微生物的信号传导,育性,抗菌剂,抗紫外辐射中起重要作用。拟南芥(Arabidopsis thaliana)等植物中种皮色素的主要成分是原花青素单体的聚合物,是由公共苯丙烷-类黄酮-原花青素途径合成的。拟南芥种皮透明是由于类黄酮合成途径中各种步骤的缺陷导致的,这使得分析单个类黄酮基因的作用变得可行。其中二十多个改变种皮颜色的功能位点已经被鉴定。二氢黄酮醇4-还原酶(Dihydroflavonol 4-reductase,DFR)是类黄酮合成途径中形成花青素与原花青素的一个关键酶。拟南芥中的单拷贝DFR基因被人工采用X-射线照射而失活后,变异植株由于种皮原花青素的合成受堵而表现出黄籽性状。对埃塞俄比亚芥黄籽与黑籽近等基因系的比较研究表明,发育中的种子和幼苗叶片中色素的合成受控于DFR位点,黄籽中色素的缺乏主要是由于存在一个对温度敏感的DFR调节因子。通过对甘蓝型黄籽油菜与黑籽比较研究发现,黄籽中DFR基因的表达和酶活性严重减少,种皮PA合成强度比其他部分大幅减弱,认为黄籽品系的PA代谢途径中DFR基因的低水平表达是黄籽性状形成的重要原因。芸薹科(旧称十字花科)植物甘蓝型油菜(Brassica napus)、白菜(B. rapa)、甘蓝(B. oleracea)与拟南芥为同一个科,含有重要的蔬菜、油料、观赏、饲料、染料和药材等作物。黄籽油菜因其含油量高,种皮薄,质量好而成为一个颇受渴望的材料,其饼粕因纤维含量低,代谢能量高成为很好的动物饲料。因此,克隆芸薹属DFR基因和验证其功能是揭示芸薹属植物种皮发育、种皮色素积累机理的重要内容,并为油菜黄籽性状分子的育种奠定了基础。本研究补充克隆了白菜,甘蓝,甘蓝型油菜的DFR基因家族的基因组序列,并对其进行了的生物信息学分析,确定了三物种中DFR成员的数目。构建了它们的RNA干扰载体和正义表达载体,RNA干扰载体转化了甘蓝型油菜黑籽品种中双10号并获得一批转基因苗,调查了抑制DFR表达后农艺性状及生化成分的变化,采用半定量RT-PCR检测了DFR基因家族RNA干扰后花和花后20天种子中DFR总体及各个成员的表达情况,主要研究结果如下：1.重新克隆和鉴定了白菜、甘蓝、甘蓝型油菜DFR基因家族基于此前的研究和电子克隆,我们设计了3对引物,用这三对引物用梯度PCR分别扩增黑籽白菜、油菜和甘蓝型油菜的基因组DNA,最高退火温度回收,然后再用两对特异引物进行检测。从黑籽白菜基因组DNA中扩增出BrDFR1和BrDFR2两条基因,BrDFR1基因全长为1781bp,BrDFR2基因全长为1806 bp。从黑籽甘蓝基因组DNA中扩增出BoDFR1、BoDFR22条基因和1条假基因BoDFRpse;BoDFR1基因全长为1794bp,BoDFR2基因全长为1814 bp,BoDFRpse为1920bp。从黑籽甘蓝型油菜基因组DNA中扩增出甘蓝型油菜BnDFR1、BnDFR22条基因和1条假基因BnDFRpse,BnDFR1基因全长为1794bp,BnDFR2基因全长为1781 bp,BnDFRpse为1920bp。2.白菜、甘蓝、甘蓝型油菜DFR基因家族的同源性与进化分析NCBI Blastn同源分析表明甘蓝型油菜DFR1全长基因组序列(BnDFR1)与甘蓝DFR1全长基因组序列(BoDFR1)有着最高的同源性,甘蓝型油菜DFR2全长基因组序列(BnDFR2)与白菜DFR1全长基因组序列(BrDFR1)有着最高的同源性,甘蓝BoDFRpse基因与甘蓝型油菜BnDFRpse基因有最高的同源性。序列比对表明BnDFR1与BoDFR1;BnDFR2与BoDFR2;BnDFRpse与BoDFRpse之间在全长基因组水平的一致性分别为100%、100%、99.5%。这充分说明,异源四倍体甘蓝型油菜中的BnDFR1和BnDFRpse来自二倍体祖先物种甘蓝中的BoDFR1和BoDFRpse,BnDFR2分别来自二倍体祖先物种白菜中的BrDFR1。DFR基因位点的证据支持甘蓝型油菜是白菜和甘蓝的3倍化物种,这些证据也表明芸薹属祖先中DFR位点“三倍化”加倍后发生了成员丢失和假基因化,导致现在的二倍体物种中只有一条功能性的DFR基因,异源四倍体物种中只有2条功能性DFR基因。二倍体的甘蓝与白菜中的DFR位点是杂合的,似乎是出于功能强化或多样化的需要。3.构建了芸薹属DFR基因家族RNAi载体和4个正义表达载体克隆了600 bp的芸薹属DFR基因家族的RNA干扰片段,利用NcoⅠ+AatⅡ双酶切将反义片段亚克隆到pFGC5941M的启动子与间隔区之间,利用BamHⅠ+XbaⅠ双酶切将正义片段亚克隆到pFGC5941M的间隔区与终止子之间,构建了11400bp的RNA干扰载体pFGC5941M-BDFRI。通过多重PCR鉴定证实载体构建成功,并转化到根癌农杆菌菌株LBA4404中形成了工程菌株。利用克隆的芸薹属DFR基因家族4个成员的全长基因组序列,用BamHI+XbaI双酶切将BnDFR1/BoDFR1、BoDFR2、BnDFR2/BrDFR1、BrDFR2分别亚克隆到本课题组创建的平台载体pC2301M1BDP上,形成了植物正义表达载体pC2301M1BDP-BnDFR1/BoDFR1,pC2301M1BDP-BoDFR2, pC2301M1BDP-BnDFR2/BrDFR1,pC2301M1BDP-BrDFR2。4.RNAi转基因表明DFR是芸薹属的种皮色素性状的重要功能位点采用改良叶盘法,将RNA干扰载体pFGC5941M-BDFRI的工程菌株转化甘蓝型油菜的黑籽品种中双10号的下胚轴,获得了36株抗Basta的再生植株,经多重PCR检测表明其中至少有14株是转基因阳性植株。在转基因植株的生长发育过程中,系统地进行了性状观察,结果表明,RNA干扰抑制芸薹属DFR基因家族后,转基因甘蓝型油菜在茎叶色彩、生长发育、形态学等性状上与对照没有明显差异。收获的转基因种子与非转基因的阴性对照表明,转基因种子的颜色明显变浅,外观呈淡褐色和褐色,与对照的典型黑色对比明显。种子色度分析表明,转基因种子比非转基因种子的粒色R值平均升高了49.92%,种子千粒重略有下降。此研究表明,在甘蓝型油菜等芸薹属植物中,DFR基因家族主要参与种皮色素积累的过程。5.转基因植株花和花后20天种子中BnDFR基因家族的抑制程度提取了对照和10个转基因植株花和花后20天种子的RNA,用半定量RT-PCR的方法检测了DFR基因家族在非转基因阴性对照和转基因植株花和花后20天种子中的表达情况。与对照相比,BnDFR在RNA干扰后的转基因植株总体和单个成员表达的下调都较明显。不同转基因植株间BnDFR表达下调不同,说明了不同独立转化事件的转基因植株间在修饰效果上存在差异BnDFR及其成员在花后20天种子中的表达量要比花中的高,这与本课题组DFR在器官组织特异性的研究是一致的。