【摘 要】
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苏云金芽胞杆菌是一种产芽胞的革兰氏阳性菌,其主要特点是在芽胞形成过程中可以分泌由杀虫晶体蛋白组成的伴胞晶体,因而被广泛应用于害虫防治。聚-β-羟基丁酸（PHB）是细菌体内重要的碳源储藏物,PHB由乙酰辅酶A经β-酮硫解酶（P ha A）、乙酰乙酰辅酶A还原酶（Pha B）、PHB合成酶（Pha C）催化合成;PHB的分解则经PHB降解酶（Pha Z）、羟基丁酰辅酶A脱氢酶（Bdh A）、β-酮硫解
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苏云金芽胞杆菌是一种产芽胞的革兰氏阳性菌,其主要特点是在芽胞形成过程中可以分泌由杀虫晶体蛋白组成的伴胞晶体,因而被广泛应用于害虫防治。聚-β-羟基丁酸（PHB）是细菌体内重要的碳源储藏物,PHB由乙酰辅酶A经β-酮硫解酶（P ha A）、乙酰乙酰辅酶A还原酶（Pha B）、PHB合成酶（Pha C）催化合成;PHB的分解则经PHB降解酶（Pha Z）、羟基丁酰辅酶A脱氢酶（Bdh A）、β-酮硫解酶将其还原成乙酰辅酶A。PHB在细菌生长对数期大量积累,进入稳定期后开始大量消耗为菌体必要的生存活动提供碳源及能源物质,因此很多研究认为PHB与芽胞及伴胞晶体的形成过程密切相关。通过生物信息学分析发现,在已测序的3500多株细菌中,约760株细菌存在P HB代谢相关基因。而在芽胞杆菌属中,PHB仅存在于巨大芽胞杆菌及蜡样芽胞杆菌群中,但是在枯草芽胞杆菌群中并没有PHB相关基因,因此我们推测PHB代谢途径与芽胞及伴胞晶体形成并无必然的联系。为进一步探究芽胞杆菌中PHB相关基因的功能及其对代谢网络的影响。本实验利用基于归巢内切酶I-Sce I的无标记的敲除方法,构建了苏云金芽胞杆菌BMB171的PHB合成酶编码基因pha C缺失突变体Δpha C及PHB降解酶编码基因pha Z缺失突变Δpha Z,并将携带有杀虫晶体蛋白的p BMB-cry1Ac10载体分别导入上述三种菌株中,得到BMB171-cry、Δpha C-cry和Δpha Z-cry。经初步的表型检测发现,在GY S培养基生长条件下,Δpha C、Δpha Z与原始菌株BMB171的生长速率基本一致;且在扫描透射电镜观察中,菌体的形态大小及芽胞形成时间均无明显差异;通过芽胞计数实验及芽胞相关基因转录情况的测定得知,pha C及pha Z基因的敲除并不影响菌体芽胞形成数量;另外杀虫晶体蛋白的提取、浓度测定及棉铃虫的杀虫活性测定均表明杀虫蛋白晶体的形成并未受到PHB变化的影响。然而我们通过测定PHB代谢动力学曲线得知,突变体Δpha C不能积累PHB,而突变体Δpha Z在芽胞期仍然可以降解PHB,但降解速率较出发株BMB171较慢。该结果表明在苏云金芽胞杆菌中,PHB合成酶仅由BMB171＿C1161编码,而PHB降解酶除了由BMB171＿C2975编码以外,可能存在其他PHB降解酶或者降解机制,最终使得能够降解PHB的菌体因得到必须的能量而存活,不能降解PHB的菌体因无能量供应而死亡。由此我们可以得出,在苏云金芽胞杆菌BMB171中PHB代谢途径与芽胞及伴胞晶体形成途径并无直接联系,PHB存在的意义并不是专为芽胞及伴胞晶体的形成提供能量,作为一种储能物质,当PHB不能在菌体中合成时,剩余的能量可能通过三羧酸循环,脂循环等其他代谢途径转化成非PHB储能物质;而在PHB不能被降解时,菌体可能会激活其他的降解酶或降解途径,以维持能量的正常供应。
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