目的:A族链球菌(Group A Streptococcus,GAS or Streptococcus pyogenes)是一种革兰氏阳性菌球菌,又称β乙型溶血性链球菌,能引起咽炎,还可引起严重感染,如链球菌中毒性休克综合征,败血症,或链球菌感染后的一些后遗症,如:风湿性心脏病,关节炎,肾小球肾炎。据估计,每年,GAS引起的咽炎在5亿例以上,脓皮病在1亿例以上,而风湿性心脏病和侵入性感染等严重的A族链球菌疾病可导致至少500000人死亡[2]。侵入性GAS疾病的死亡率在15-30%之间,但在链球菌中毒性休克综合征病例则可超过50%。更严重的是,GAS能引起严重的自身免疫性疾病,如风湿热,风湿性心脏病,风湿性关节炎,风湿性肾小球肾炎等严重的后遗症。尽管目前链球菌仍然对青霉素敏感,但是为了预防这些严重后遗症的发生,预防性疫苗的应用仍然是必要的。因此,有效的疫苗接种显然有可能成为一个控制GAS感染的好方法,它不仅能显著降低侵入性和非侵入性疾病的发生,减少抗生素的使用,从而促进对A组链球菌和其他重要的人类病原体的抵抗,更重要的是能避免那些严重的自身免疫性并发症的出现。但研究较多GAS M蛋白的血清型超过100多个,并且M蛋白诱导的体液和细胞免疫反应与自身免疫性链球菌感染后并发症有一定的联系,这些因素阻碍了M蛋白质疫苗开发。其他候选疫苗,如,链球菌纤维连接蛋白Sfb I等,它们或者不在大多数GAS菌株表达或者显示出太大的氨基酸序列的多样性或者其表面表达水平在不同血清型之间差异太大。因此,都不是成为理想的疫苗。最近反向疫苗学被用来从GAS中识别新的候选疫苗,这些方法的优点在于充分利用了GAS的几个基因组序列。近期有文章称,利用抗原组学技术系统的鉴别筛选出了一些新的保守的保护性抗原。通过这些研究,发现了一些具有疫苗潜力的新抗原,这些新抗原在GAS临床分离株中都是高度保守的。Spy1536基因编码的假想蛋白就是其中的抗原之一。基因敲除研究已证实,此基因在调节GAS多种蛋白的表面表达和链球菌细胞与宿主蛋白之间的相互作用过程中发挥了重要作用。在本实验中我们构建pcDNA3.1/Spy1536真核表达基因疫苗,并用动物实验验证其保护效果。方法:1用primer5.0软件设计相应引物,用PCR方法扩增出Spy1536基因,并用琼脂糖凝胶电泳分离回收。2 PGEM-T/Spy1536构建:将上述回收产物与p GEM-T载体连接,转化E.coli DH5α大肠杆菌,构建克隆载体p GEM-T/Spy1536,阳性克隆送生物公司测序鉴定。3 pcDNA3.1/Spy1536构建:经过鉴定的p GEM-T/Spy1536阳性克隆和pcDNA3.1空载体分别用Bam HⅠand XhoⅠ双酶切,经电泳回收阳性片段并与用相同酶切过的pcDNA3.1空载体连接,经过转化、筛选和酶切电泳鉴定后,成功构建真核表达重组质粒pcDNA3/Spy1536。4质粒大提:真核质粒pcDNA3/Spy1536转化到E.coli DH5α,用SDS碱裂解法大量提取pcDNA3.1/Spy1536,同时大量提取pcDNA3.1,作为对照。5免疫动物:C57小鼠随机分为3组,即空白对照组,Spy1536组和pcDNA3.1组,每组20只。用大量提取的质粒免疫小鼠。于小鼠后肢大腿肌肉注射(100pg/只),每两周免疫一次,共三次。6免疫指标鉴定:每次免疫后两周每组各杀死3只小鼠,取心,肺,肝,脾,做HE切片染色观察病理变化。并用Real-time PCR方法检测小鼠脾脏细胞IL-4、IL-12 RNA的表达。7末次免疫后两周用致死量GAS攻击小鼠,密切观察小鼠在两周内的生存变化,做出生存曲线。结果:1用PCR方法成功扩增了Spy1536基因;2成功构建了PGEM-T/Spy1536克隆质粒和pcDNA3.1/Spy1536真核表达质粒;3Real-time PCR结果显示:Spy1536组的IL-4、IL-12水平:注射疫苗之后的各个时间点的IL-4、IL-12水平比PBS空白对照组高(P<0.05)。且整体上呈上升趋势。细菌攻击后的检测水平比细菌攻击前的检测水平高;pcDNA3.1空质粒组的IL-4、IL-12水平与PBS空白对照组的相比没有统计学差异(P>0.05)4病理结果显示:PBS空白对照组和pcDNA3.1空质粒组都正常。疫苗注射后细菌攻击之前,心,肝,肺,脾都正常。细菌攻击后,心正常,肝肺轻微损伤,脾正常;5生存率:根据小鼠死亡情况做的生存曲线来看,Spy1536组比对照组的生存情况要好,用SPSS统计学软件分析结果显示,P<0.05。结论:1经酶切鉴定及基因测序鉴定,成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1/Spy1536。2经过动物免疫验证,初步认为该基因疫苗刺激小鼠产生了一定的保护性体液免疫反应,对小鼠有一定的保护作用。