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背景和目的甲状腺乳头状癌（PTC）是最为常见的内分泌恶性肿瘤,近年来在世界上多个地方的发病率呈快速上升趋势[1-4]。PTC相对惰性,如果早期发现并经过正规的治疗,多数可以治愈。但是在临床工作中我们又发现,有些微小癌在发现时已经出现了广泛的转移,预后较差。那么,如何能更精准的早期诊断,寻找与肿瘤外侵、转移、复发等高危行为相关的因素,寻找潜在的更有效的治疗靶点,成为亟待解决的问题。本研究的目的包括以下两方面:1.通过BRAFV600E突变检测和miRNA363表达水平检测,明确BRAFV600E突变是否与高危肿瘤行为相关;明确双分子检测在甲状腺微小乳头状癌的早期诊断中的价值;2.以甲状腺乳头状癌细胞株（TPC-1细胞）为研究对象,探讨miRNA363对TPC-1细胞的增殖、分化、转移的影响,并进一步研究其作用机制,寻找潜在的治疗甲状腺乳头状癌的新靶点。第一部分miRNA363、BRAFV600E在甲状腺微小乳头状癌中的表达研究目的探讨甲状腺微小乳头状癌中BRAFV600E突变情况与各高危因素分析;分析甲状腺微小乳头状癌和癌旁正常组织及甲状腺良性结节中miRNA363表达差异及BRAFV600E突变情况,分析miRNA363及BRAFV600E用于甲状腺微小乳头状癌早期诊断的价值。方法收集研究自2016年1月至2017年2月入院的同一医师收治手术的甲状腺乳头状癌患者的石蜡病理标本62例,肿瘤最大直径均小于1cm,患者最后诊断结果均经病理证实为甲状腺微小乳头状癌,登记患者性别、年龄、家族史、是否多灶、是否有包膜侵犯、是否有淋巴结转移,并进行肿瘤TNM分期;实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测标本中BRAFV600E突变情况,并进行统计学分析。另收集患者49例新鲜手术标本,其中26例为甲状腺微小乳头状癌患者标本,23例为甲状腺良性肿瘤及癌旁正常组织标本,登记甲状腺微小乳头状癌患者性别、年龄、家族史、是否多灶,是否有包膜侵犯、是否有淋巴结转移,并进行肿瘤TNM分期;PCR检测标本中miRNA363表达水平及BRAFV600E突变情况,并进行统计学分析。结果自2016年1月至2017年2月,收集由同一医师完成手术的PTMC患者病理标本进行检测,共62例;其中男13例,女49例;最低年龄20岁,最高年龄64岁,平均年龄45.8岁;通过PCR检测BRAF基因状态,BRAFV600E突变患者44例,野生型患者18例,突变率为71%。统计学分析显示,在BRAFV600E突变与未突变的患者中,除了45岁以上和45岁及以下患者对比,有统计学差异;在性别、家族史、病灶数目、包膜侵犯情况、淋巴结转移情况和肿瘤分期等高危因素不同的患者中均未见统计学差异。收集用于检测miRNA363和BRAF突变的新鲜标本49例,26例甲状腺微小乳头状癌标本,23例甲状腺良性肿瘤及癌旁正常组织标本。miRNA363表达水平在甲状腺微小乳头状癌组织中出现均一性降低;这种变化在BRAF突变型及野生型患者中未显示差异性。进一步分析两种分子检测的准确度,BRAFV600E检测为87.8%,miRNA363检测为100%。小结1.在甲状腺微小乳头状癌中,BRAFV600E突变率较高;但BRAF600E突变与甲状腺微小乳头状癌除年龄之外的高危生物学行为没有相关性,指导预后证据不足。2.miRNA363在甲状腺微小乳头状癌中的表达水平出现均一性降低,表达水平与BRAF是否突变无相关性;miRNA363表达差异在甲状腺微小乳头状癌的辅助诊断中具有高准确度,联合BRAFV600E突变检测,可使甲状腺微小乳头状癌的早期诊断率提高。第二部分miRNA363对甲状腺乳头状癌进展机制研究目的研究miRNA363对甲状腺癌细胞（TPC-1）增殖、分化及转移的影响;并探讨其对TPC-1细胞产生影响的机制,为miRNA363作为甲状腺乳头状癌治疗的靶向基因提供理论基础。方法1.以甲状腺癌细胞系TPC-1为研究对象,构建过表达miRNA363慢病毒质粒,通过慢病毒转染的方法将TPC-1细胞系高表达miRNA363,以空白质粒为对照,建立高表达miRNA363的稳定细胞株。2.实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测高表达miRNA363稳定细胞株（TPC-1-miRNA363）、空白质粒对照细胞株（TPC-1-LV）、空白细胞株（TPC-1-NC）中miRNA363的表达情况。3.MTT检测miRNA363对TPC-1细胞增殖能力的影响。4.通过Transwell小室模型验证miRNA363对TPC-1细胞侵袭能力的影响。5.通过划痕实验证实miRNA363对TPC-1细胞迁移能力的影响。6.通过克隆形成实验验证miRNA363对TPC-1细胞群体依赖性和增殖能力的影响。7.经过生物信息学预测,筛选出了miRNA363的两个靶基因:Ca离子信号通路中CACNA1C基因和MAPK信号通路中DUSP10;构建miRNA363过表达质粒、CACNA1C 3-UTR、DUSP10 3-UTR、CACNA1C 3-UTR-Mu、DUSP10 3-UTR-Mu的荧光素酶质粒,转染细胞后,经过处理,测定并计算各组相对luciferase活性。8.Western-Blot方法检测实验组和对照组CACNA1C、DUSP10蛋白表达情况。结果1.RPMI1640+10%FBS培养基培养TPC-1细胞,利用慢病毒成功建立miRNA363高表达细胞株TPC-1-miRNA363,空质粒对照细胞株TPC-1-LV。2.qPCR检测结果显示,miRNA363在TPC-1-miRNA363组表达明显增高。3.慢病毒感染TPC-1细胞,培养5天后,经MTT处理4小时,记录各组细胞在490nm的吸光率相对于第一天的变化倍数随时间的变化。相比TPC-1-NC和TPC-1-LV对照组,TPC-1-miRNA363组细胞增殖倍数经T-test分析P<0.05,出现细胞增殖的明显抑制;而两个对照组之间对比,P>0.05,细胞增值未见明显差异。4.Transwell实验显示,在200x显微镜视野细胞计数,TPC-1-NC和TPC-1-LV对照组平均为193和185,TPC-1-miRNA363组计数为81,在实验组细胞数目减少。5.划痕实验,将感染细胞进行培养,按照实验方法进行划痕,相比对照组,TPC-1-miRNA363组细胞在划痕24h时迁移能力下降。6.克隆形成实验显示,TPC-1-NC和TPC-1-LV对照组克隆形成数为202和198,TPC-1-miRNA363组克隆形成数为188,在高表达miRNA363基因的实验组形成的克隆数目减少。7.荧光素酶实验显示,结果表明miRNA363特异性下调了CACNA1C及DUSP10基因表达。8.Western-Blot结果表明,在TPC-1-miRNA363细胞中,miRNA363特异性降解了CACNA1C及DUSP10蛋白表达。小结（1）miRNA363在TPC-1中是肿瘤抑制基因,高表达可以抑制TPC-1的生长,对肿瘤细胞的转移有一定的影响。（2）miRNA363是通过特异性靶向Ca离子信号通路中的CACNA1C基因及MAPK信号通路中的DUSP10基因的3′端非翻译区,导致mRNA的降解,致使蛋白翻译的失败,起到肿瘤抑制作用的。（3）在TPC-1中作为肿瘤抑制基因,miRNA363有可能作为甲状腺乳头状癌治疗的潜在靶向基因。结论1.在甲状腺微小乳头状癌中,BRAFV600E突变率较高,但该突变与除年龄之外的高危生物学行为没有相关性,指导预后证据不足;miRNA363在甲状腺微小乳头状癌中的表达水平出现均一性降低,表达水平与BRAF是否突变无相关性;联合BRAFV600E突变检测,可使甲状腺微小乳头状癌的早期诊断率提高。2.miRNA363作为肿瘤抑制基因,是通过特异性靶向Ca离子信号通路中的CACNA1C基因及MAPK信号通路中的DUSP10基因的3′端非翻译区,导致mRNA的降解,致使蛋白翻译的失败,进而抑制甲状腺乳头状癌细胞的生长,有可能作为甲状腺乳头状癌治疗的潜在靶向基因。