唾液酸是一种以九个碳原子作为骨架的酸性糖,常以单体或多聚形式存在于糖链末端。细胞以葡萄糖为底物,经过一系列酶催化过程合成唾液酸,最终由唾液酸转移酶将唾液酸添加至糖链中。已证实唾液酸在肿瘤的发生发展过程中具有重要的生物学功能,例如帮助肿瘤细胞躲避免疫系统监控,促进肿瘤相关血管生成,促进肿瘤细胞增殖和迁移,增加肿瘤细胞对化学治疗和放射线治疗的抵抗。唾液酸修饰受唾液酸转移酶和唾液酸酶共同调控。唾液酸转移酶在肿瘤组织中常高表达,且有助于癌细胞累积唾液酸修饰,但唾液酸酶在肿瘤中的作用仍存在争议。膀胱癌是起源于膀胱的恶性肿瘤,也是泌尿系统中最常见的肿瘤,男性发病率较高。膀胱癌因进展迅速且治疗方法有限,严重威胁着患者生存质量。本文以膀胱癌为主要的研究模型,结合基于质谱的糖组学和蛋白组学技术,研究了唾液酸修饰和膀胱癌发生发展的关联及分子机理,并探索了小细胞外囊泡唾液酸修饰在囊泡内吞过程中的作用,此外还针对唾液酸修饰,改进了基于质谱检测唾液酸不同键型的样品制备方法。主要结论如下:(1)改进基于滤膜的唾液酸质谱样品制备方法,使用二甲胺/氨水衍生化方法区分α2,3和α2,6连接唾液酸。该方法基于α2,3唾液酸与临近半乳糖形成内酯的特性,在EDC和HOBt的催化下,使用二甲胺和氨水对α2,3和α2,6唾液酸进行不同衍生化,借助质谱区分二者。以唾液酸化乳糖(α2,3唾液酸修饰乳糖和α2,6唾液酸修饰乳糖)及糖蛋白(胎球蛋白和重组人乳铁蛋白)为模型,验证了该样品制备及衍生化方法可以有效鉴定两种方式连接的唾液酸修饰。继而利用该方法分析了肿瘤细胞在常氧和低氧状态下的N-糖修饰变化。该方法在鉴定N-糖链结构的同时能表征唾液酸α2,3和α2,6连接类型,扩展了质谱所获得的糖组信息。(2)膀胱癌唾液酸修饰的异常增加与唾液酸酶NEU1低表达有关。经高通量N-糖组学分析发现恶性膀胱癌细胞含有较多唾液酸修饰。检测唾液酸酶活性,发现膀胱癌唾液酸修饰增加与总唾液酸酶活性低有关。经高通量蛋白质谱检测,发现膀胱癌细胞表达的唾液酸酶主要为NEU1,且恶性膀胱癌细胞NEU1表达量较低。使用凝集素和NEU1抗体荧光染色、激光共聚焦等实验检测,发现膀胱癌细胞NEU1表达量与唾液酸修饰呈负相关趋势。分析临床样本发现膀胱癌患者癌组织中NEU1的表达水平显著低于癌旁组织,且NEU1表达量与唾液酸修饰负相关,NEU1的低表达预示着患者有更短的生存期。(3)唾液酸酶NEU1催化降低纤维连接蛋白(FN)的唾液酸修饰,抑制由整合素α5β1介导的Akt磷酸化和细胞增殖。通过慢病毒感染的方式构建了高表达NEU1的膀胱癌细胞株YTS-1/NEU1。经检测YTS-1/NEU1细胞唾液酸修饰显著减少,且细胞增殖减缓、凋亡增加,细胞周期G0/G1期占比增加。经蛋白相互作用实验和免疫共沉淀等实验证实,部分NEU1定位于细胞膜并导致FN的去唾液酸化,而FN唾液酸修饰影响其与整合素α5β1的亲和力。因此FN去唾液酸修饰致使由整合素介导的与细胞黏附相关的信号通路减弱,促进细胞内吞并降解整合素α5β1和FN,导致细胞增殖减缓,凋亡增加。利用裸鼠皮下成瘤实验证明在体内条件下NEU1可以减少唾液酸修饰,降低FN、整合素α5β1表达并抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。(4)小细胞外囊泡(sEV)的唾液酸修饰影响其被受体细胞摄入,可为膀胱癌临床诊断提供参考。通过凝集素印迹实验和ELISA等实验发现膀胱癌细胞分泌的sEV含有丰富的唾液酸修饰。膀胱癌细胞sEV能被正常膀胱细胞摄入,且激活其Akt信号通路,促进细胞增殖。对sEV的去唾液酸处理明显降低了其进入受体细胞的速率,且弱化了sEV对细胞的Akt通路的激活。通过检测48例膀胱癌患者和30例健康志愿者血浆和血浆sEV的唾液酸修饰水平,发现膀胱癌患者血浆和血浆sEV唾液酸修饰均显著高于健康志愿者。且以sEV唾液酸修饰水平作为膀胱癌检测指标,有较高准确性,可为临床诊断膀胱癌提供参考。