背景及目的：　　 胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES细胞)是囊胚期的内细胞团在体外建立的稳定的细胞系。ES细胞具有干细胞的全能性，重新移植入发育中的囊胚能够形成嵌合体小鼠，也能在体外诱导分化成机体多种类型的细胞，是临床退行性病变和组织损伤的潜在替代材料。　　 哺乳动物的中枢神经系统(central nervous system，CNS)发育起始于外胚层神经上皮的诱导分化，形成神经板。随后神经上皮快速扩增，神经板折叠并融合形成神经管。其中，神经管前端膨大区形成脑，后段发育为脊髓。在神经管前部的预定脑区，神经管局部膨大，形成结构上区分明确的前脑(forebrain)、中脑(midbrain)和后脑(hindbrain)。前脑逐渐发育并分化为端脑(telencephalon)和间脑(diencephalon)；而端脑进一步区分为背侧和腹侧；背侧端脑最终形成大脑皮层和海马(以及嗅脑)。大脑皮层是一切高级神经活动的中心，而海马是记忆存储的主要区域，它们均来源于端脑(或者模糊称为“前脑”)背侧神经元神经前体细胞。小鼠大脑皮层的发育起始于胚胎第10天(E10)，增生的前体细胞位于脑室带(ventricularzone，VZ)和室下带(sub-ventricularzone，SVZ)，而新生的神经元则离开增殖区，沿辐辏方向向表层迁移。出生时，大脑皮质由6层细胞组成，它们按照由内向外的顺序依次生成，即先生成的神经元位于皮质底层，而后生成的神经元位于皮质表层。　　 大体上，体外ES细胞向神经元的诱导分化方案可归为两大类：(1)贴壁生长的单层胚胎干细胞；(2)悬浮生长的胚胎干细胞团。前者主要依赖培养基和培养基内生长因子的调控；后者除了培养基的因素，还包括细胞间的相互影响。Lee等诱导ES细胞形成类胚体(embryoid body，EB)，包含三个胚层起源的多种细胞类型。在这种混合细胞团中，神经干细胞(neural stem cell，NS cell)能够在含FGF2和EGF的神经干细胞培养基中得到扩增；并且扩增的NS细胞经Shh和FGF8b因子处理后，诱导产生包括多巴胺能神经元在内的多种中、后脑神经元类型。　　 控制前脑分化的信号主要有Wnt，BMP，FGF和Shh通路等。其中Wnt信号分子对于皮质神经元的产生和类型分化具有重要影响。在胚胎发育早期，Wnt分子沿神经管从前到后浓度逐渐增加的梯度分布，诱导大脑中、后部神经元特征。而发育相对晚期，鸡胚的Wnt基因富集在预定的前脑背侧或者其邻近区域，参与前脑背侧神经元的发生和发育，当Wnt信号受到阻断时，背侧神经元标志Emxl，Pax6和Ngn2不能表达；而Wnt通路激活时，作用范围内的神经元失去其腹侧特征，而转化为背侧神经元。小鼠胚胎研究中，经典Wnt通路受到阻断时也得到与之一致的结论。　　 特异性基因标志是研究体内外细胞分化的重要工具。例如，转录因子Sox2基因上游一段5.7 kb的序列包含一个增强子，能够驱动Sox2基因的表达；在该增强子下游添加一段(beta)-geo序列，可观察到该增强子激活的Sox2表达最早出现于胚胎发育的第3.5天(embryo3.5，E3.5)，至E12.5天表达范围局限于脑室带(ventricularzone，VZ)等包含大量神经干细胞的区域[5]。另一项研究采用Cre/loxP重组系统，将cre基因定点连接在FoxG1基因簇，并通过FoxG1-cre与3个不同的loxP报告基因的小鼠的杂交，得到基因重组小鼠，显示正常的胚胎发育中，FoxG1分布于端脑、视泡、嗅上皮、中后脑交界等部位。最近一项研究使用cre和Emx1基因重组，显示Emx1基因表达在E9.5天开始出现，最早位于前脑背侧，并在发育后期分布于海马CA1-CA3区，以及齿状核[7]。另外，一种神经前体细胞的特异性中间丝蛋白nestin的增强子，与lacZ报告基因融合，显示nestin在神经板和随后的神经管上增生细胞中的表达。　　 然而，这些报道中荧光蛋白尚不能代表神经系统的皮层发育阶段，即前脑背侧神经元的分化及增殖情况。胚胎发育12.5-15.5天对前脑背侧神经元特异性标记的D6-GFP转基因小鼠，提供了皮质发育的理想模型。Stefan Krauss实验室建立的D6-GFP转基因小鼠携带绿色荧光蛋白(green flurescentprotein，GFP)基因，该报告基因接受背侧前脑特异性表达的Dach1基因增强子D6的调控。从小鼠胚胎10.5天起，前脑区域出现散在的GFP+细胞，逐渐分布于整个背侧前脑，并持续至出生后。组织学染色证实D6-GFP+细胞主要为新皮层及海马的神经前体细胞和神经元。因此，本实验的目的(1)体外扩增培养D6-GFP转基因小鼠的胚胎干细胞；(2)探索诱导胚胎干细胞分化的方法，观察前脑背侧神经元/神经前体细胞的特定亚群在体外分化和增生情况；(3)探讨Wnt信号通路对胚胎干细胞向前脑背侧神经元诱导的影响，以期优化诱导方案。　　 方法：　　 1.不同细胞的体外培养：　　 (1)D6-GFP小鼠胚胎干细胞在添加白细胞抑制因子1000 U/ml(leukemiainhibitory factor，LIF)的含10％胎牛血清的培养基中培养和传代。　　 (2)普通类胚体(normal embryoid body，nEB)在含5％基因敲除的血清替代物(KSR)的无血清培养基中悬浮培养；　　 (3)快聚类胚体(quick embryoid body，qEB)在含5％基因敲除的血清替代物(KSR)的无血清培养基中，置于弧形底的96孔板培养。　　 (4)流式分选的D6-GFP+细胞在含bFGF10 ng/ml，和EGF20ng/ml，以及B271Unit/ml的神经培养基中培养。　　 2.免疫细胞化学检测：分别制备不同的免疫细胞化学检测样本，其中胚胎干细胞检测使用细胞爬片，nEB为附着于多聚赖氨酸的细胞球，qEB为OCT冷凝剂包埋的-20℃制备的冰冻切片，分化的神经球细胞爬片，进行常规免疫细胞化学染色，包括固定，通透，抗原封闭，一抗孵育，二抗孵育和核染色等步骤。其中二抗使用荧光共轭抗体，反应结束后在荧光显微镜下观察染色结果。　　 3.定量PCR检测：提取RNA，标本来自(1)胚胎干细胞，分化6天的nEB，分化12天的nEB，以及培养的前脑神经干细胞。(2)qEB细胞中显微解剖得到的D6-GFP阳性和非阳性细胞。使用全RNA提取试剂盒提取RNA，使用寡核苷酸引物p(NT)6合成cDNA和逆转录试剂盒合成cDNA，使用SYBR绿色荧光定量PCR试剂盒进行检测。　　 4.流式细胞检测：选取不同代数的胚胎干细胞，使用胰酶/EDTA消化和分散后，调节细胞终浓度为0.5×106/ml，在PBS中使用SSEA-1(IgM)单克隆抗体进行抗原-抗体反应，加入Alexa594-荧光共轭二抗后，冲洗，使用FACS AriaⅡ流式细胞仪进行阳性细胞的定量检测。　　 5.流式细胞分选：取含有D6-GFP+细胞簇的快聚类胚体，使用胰酶/EDTA消化和分散后，使用FACS AriaⅡ流式细胞仪进行样本检测和分选。GFP信号的采集波长范围是488±5nm。分别收集D6-GFP阳性和非阳性细胞。　　 6.统计学处理：所有检测重复2遍以上。定量检测的指标中，统计数值使用mean±S.E.M表示，组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有显著性。　　 结果：　　 1.胚胎干细胞的体外扩增　　 1.1 D6-GFP转基因小鼠ES细胞的形态学：D6-GFP小鼠ES细胞呈现单层贴壁生长，细胞紧密排列，边界不明显，而成片生长的细胞周围边缘光滑。　　 1.2 D6-GFP小鼠ES细胞的增殖特点：小鼠ES细胞处于活跃的细胞分裂期，增殖迅速，平均约每1.5天扩增8倍。　　 1.3 D6-GFP小鼠ES细胞表达原始细胞标志：ES细胞强表达原始干细胞特征分子Oct4和Sox2，而分化细胞(神经元/神经前体细胞)的标志则为阴性。　　 2.胚胎干细胞向神经细胞分化-普通类胚体　　 2.1 普通类胚体(nEB)的形成：D6-GFP小鼠胚体干细胞悬浮生长为普通类胚体(normal embryoid body，nEB)，nEB在1-2天内形成，大小不等，呈现球形或橄榄形，培养早期类胚体表面光滑，细胞聚集紧密；后期在表面附着有少量坏死细胞或细胞碎片。　　 2.2 普通类胚体(nEB)中分化细胞的基因表达的动态变化：比较胚胎干细胞，分化6d的nEB，分化12天的nEB，以及培养的前脑来源的神经干细胞。结果显示，(1)全能性干细胞的标志Oct4，Nanog，和Klf4表达逐渐减弱，前脑神经组织的特异性分子FoxG1，Pax6，Sox5，和Dach1等分子表达上调。(2)同时，Nkx2.1，Hoxb9和GFAP等非前脑组织特异分子，和Brachyury(Bra)和Vimentin等非神经的组织特异分子的表达也有上调。(3)经典Wnt信号通路的分子基因表达也有变化.　　 2.3 nEB细胞分化为神经元/神经前体细胞：对完整的附着于玻璃盖玻片表面的nEB，进行免疫细胞化学检测。结果显示nEB细胞，表达神经相关的细胞标志nestin，Tujl和GFAP。然而，在悬浮生长的nEB内，D6-GFP+细胞几乎不可见；经固定和免疫细胞化学染色强化后，少数EB显示出GFP的表达。　　 3.胚胎干细胞向前脑背侧神经元的分化-快聚类胚体　　 3.1 动态观察快聚类胚体(qEB)的形成：悬浮的D6-GFP小鼠胚胎干细胞，在96孔培养板快速聚集(<24 hr)成快聚类胚体(quick embryoid body，qEB)。qEB形成迅速，细胞团大小一致；在相同的分化时间，细胞团体积远大于普通类胚体(nEB)。qEB通常诱导ES细胞产生D6-GFP+细胞，D6-GFP+细胞出现在大约分化第10天，每个qEB细胞团通常包含1-2个D6-GFP+细胞簇，D6-GFP+qEB的产生几率约为40％(n=6)。使用不同因子处理，提示bFGF/EGF提高D6-GFP+qEB的几率至75％(n+2)，但D6-GFP+细胞占细胞总数的百分比从35％减少至19.6％。同时，bFGF/EGF因子处理的D6-GFP+细胞的荧光相对较暗。　　 3.2 快聚类胚体(qEB)中分化细胞的分子标志：qEB冰冻切片的免疫细胞化学染色显示D6-GFP+细胞与前脑背侧神经元/神经前体细胞标志Sox2，Pax6，Tbr1和Tbr2等表达重合。D6-GFP+细胞簇内细胞的单极表达N-cadherin分子。　　 3.3 快聚类胚体(qEB)中D6-GFP阳性和非阳性细胞基因表达：基因表达检测显示前脑蛋白FoxG1和前脑背侧神经元标志Dach1，Pax6和Sox5在D6-GFP阳性细胞中的表达量多于非阳性细胞。　　 3.4 Wnt信号通路在细胞分化中的调控作用：qEB培养的后期用Wnt信号通路的激动剂和抑制剂处理。未处理组D6-GFP+细胞比率为35％，Wnt3a分子处理后增加至57％，Dkk1处理后减少至18％。全反式维甲酸处理，无GFP+细胞产生。　　 3.5 快聚类胚体(qEB)来源的D6-GFP+细胞具有神经干细胞特性　　 3.5.1 D6-GFP+细胞的增殖：流式细胞分选从qEB中获得纯化的D6-GFP阳性和非阳性细胞，其中D6-GFP+细胞在7-10天后形成神经球，球内细胞保持明亮的绿色荧光。　　 3.5.2 D6-GFP+细胞的分化：qEB来源的D6-GFP+细胞经神经球培养扩增后，在神经干细胞分化培养基(不含EGF因子)中贴壁并分化为nestin+，Tuj1+和GFAP+细胞，三者百分比分别为87.7％，9.6％，和4.2％。　　 结论：　　 1. D6-GFP小鼠的ES细胞在体外培养条件下，能够快速扩增，并维持其未分化的干细胞状态。　　 2. ES细胞经普通类胚体(nEB)诱导，表达前脑背侧神经元/神经前体细胞的分子标志，但未能有效诱导D6-GFP+细胞。　　 3. ES细胞经快聚类胚体(qEB)诱导，有效诱导D6-GFP+细胞。利用GFP+标记可以对前脑背侧神经元/神经前体细胞的增生和分化进行动态观察，定量检测，细胞分选和分子调控等实验。　　 4：qEB和nEB诱导过程均有Wnt信号通路的参与，Wnt信号的活化促进形成D6-GFP+细胞，但尚不能确定其机制是促进细胞增生还是分化。