端粒酶是一种核糖核蛋白逆转录酶,主要功能是合成端粒重复序列。在大部分肿瘤细胞中端粒酶活性呈阳性表达,因此,科研工作者将其视为一种肿瘤标识物,并对此进行了广泛的研究。目前,已经建立了多种检测端粒酶活性的方法,但是这些方法仍然存在实验过程繁琐、灵敏度低等问题。因此,发展简单快速、灵敏可靠检测端粒酶活性的方法是非常必要的。基于此,本论文建立了两种检测端粒酶活性的新方法,旨在实现对端粒酶活性简单、灵敏、可靠的检测。本文的主要研究内容可总结为以下三方面:一、基于金纳米棒荧光共振能量转移均相灵敏检测端粒酶活性的荧光法基于金纳米棒荧光共振能量转移(FRET),构建了一种无需PCR、简单、快速检测端粒酶活性的新方法。利用羧基荧光素(FAM)修饰的DNA(F-DNA)作为信号探针,由于它本身带有负电荷,金纳米棒(GNRs)带有正电荷,二者之间可通过静电作用相互靠近,发生较弱的FRET,使得F-DNA荧光强度有一定程度的下降。端粒酶存在时,端粒酶底物3’端会被延长并形成一条含有多个TTAGGG重复序列的DNA长链,它可以与大量的F-DNA杂交成双链DNA,增强的静电作用使得GNRs与F-DNA间的距离减小,FRET的效率提高,引起F-DNA荧光强度显著降低。通过端粒酶的自放大作用和GNRs的高猝灭效率,无需PCR扩增和酶辅助信号放大,可检测1个HeLa细胞提取物中的端粒酶活性。同时,该方法能够区分不同种类肿瘤细胞中端粒酶活性的差异,并能研究端粒酶抑制剂对端粒酶活性的抑制作用。因此,该方法实现了无需PCR扩增就能简单、灵敏、可靠地检测端粒酶活性,为以端粒酶为靶分子的临床诊断和抗肿瘤药物筛选提供了一种新思路。二、基于气压变化灵敏检测端粒酶活性的即时检测法临床诊断急需简便、快速、可靠灵敏检测端粒酶活性的即时检测法,基于此,我们首次提出了一种基于气压变化检测端粒酶活性的新方法。首先,通过Schiff反应将醛基化的端粒酶引物TS修饰到氨基化的磁珠表面。巯基化的cDNA通过铂-硫键作用,自组装到铂纳米颗粒(PtNPs)表面得到PtNPs/cDNA。端粒酶存在时,TTAGGG重复序列会加在TS的3’末端形成延长产物链。延长产物可以与大量PtNPs/cDNA互补杂交,使得PtNPs富集到磁珠表面。最后,利用PtNPs催化H2O2分解产生O2,用便携式气压计检测O2所产生的气压,实现对端粒酶活性的检测。利用端粒酶的自放大作用和磁珠的富集作用,可以灵敏地直接检测1个HeLa细胞裂解液中的端粒酶活性。同时,该方法可以用于检测并区分不同种类细胞中端粒酶活性的差异,并用于筛选端粒酶抑制剂。该方法具有简单快速、可靠、超灵敏的特点,将为开发更便捷实用的即时检测方法做出有益的探索。三、基于光诱导电子转移检测尿嘧啶DNA糖基化酶的活性基于鸟嘌呤(G)与荧光染料之间的光诱导电子转移(PIET),建立了一种简单、可靠、灵敏检测尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)活性的荧光法。利用茎部含有尿嘧啶(U)的发夹探针(F-hpDNA)作为UDG酶的底物,其5’端被羧基荧光素(FAM)修饰,3’端有3个G碱基。无目标分子时,发夹探针形成稳定的茎-环结构,使得G碱基靠近FAM,导致FAM的荧光被猝灭。当UDG酶存在时,F-hpDNA茎部的U碱基会被移除,导致F-hpDNA的发夹结构被打开,FAM与G碱基之间的PIET效率降低,FAM的荧光信号恢复。利用该方法可以检测低至浓度为0.0005 U mL/-1的UDG酶,而且也可用于检测细胞提取物中的UDG酶活性。因此,这是一种简单快速、可灵敏检测UDG酶活性的荧光新方法,该方法为检测其他的碱基修复酶提供了一种新思路。