白斑综合征病毒(WSSV)是一个严重影响对虾养殖业的病毒,它于1992年首先发现于东南亚地区,此后相继在世界范围内传播开来。由于其可以侵染的宿主范围非常广泛,所以每年都会给对虾养殖业带来巨大的经济损失。该病毒可以侵入多种宿主,包括多种水产动物,如对虾、蟹、淡水虾和小龙虾、以及水生节肢动物和浮游动物[5-6]。本实验拟通过分子生物学以及蛋白质组学的一些方法,来研究硫氧还原蛋白Thiordoxin(TRX)和肿瘤蛋白onoprotein(OP)与WSSV的作用情况,并通过1H NMR核磁共振光谱分析法分析感染了WSSV的凡纳滨对虾代谢产物的变化情况,以及TRX、Lv P38、CAT和POD四种基因在凡纳滨对虾感染了WSSV后的变化情况,从而来进一步的探讨WSSV的治病机理[1-4]。Part 1:硫氧还原蛋白Thiordoxin(TRX),是一个重要的细胞内抗氧化蛋白,它具有一系列生物学功能。有研究表明,TRX的基因表达量在感染WSSV的动物体内呈上升趋势。然而,TRX在WSSV感染中的作用及对相关信号通路的影响尚不清楚。序列分析表明,TRX可以与WSSV上的结构蛋白WSSV030(VP362)和WSSV454(TK-TMK)相互作用。本部分通过原核表达成功获得TRX、VP362和TK,并用Far western blot和ELISA方法证明他们之间确实可以相互作用。通过绝对定量以及相对定量的分析表明,TRX蛋白的过表达可促进IKK、Lv P38和STAT这些免疫相关的基因和细胞信号通路的相关基因在感染WSSV对虾体内的基因表达量,并且在WSSV感染对虾体内,TRX基因与VP28基因的相对表达量呈正相关。体外中和试验表明TRX在对虾体内过表达后,可加快WSSV在对虾体内的复制,并加快感染WSSV的对虾的死亡,说明TRX具有促进WSSV感染的作用。Part 2:本部分实验主要研究肿瘤蛋白(oncoprotein)OP(与NDK序列相同)与WSSV的作用关系。首先通过原核表达获得OP表达产物,亲和层析纯化出OP蛋白。采用Far western blot和ELISA方法研究OP与WSSV结构蛋白的作用,结果表明OP与WSSV膜蛋白VP28有相互作用。然后再通过体外注射OP蛋白于凡纳滨对虾体内,测量病毒拷贝数以及m RNA水平上IE1和VP28基因的相对表达量,结果表明OP蛋白可促使WSSV在对虾体内的复制,并促使WSSV感染的对虾体内的IE1和VP28基因表达量升高。体内中和试验表明,注射OP蛋白的感染WSSV的对虾,死亡时间早于其他实验对照组。RNA干扰实验表明,注射ds RNA-OP的感染组对虾,死亡时间明显延后于正常感染WSSV的对虾和其他实验对照组。由此推断,OP蛋白可以加快WSSV在对虾体内的增殖,且OP蛋白可能是一种WSSV促死蛋白。Part 3:本部分实验通过1H NMR光谱分析法分析感染WSSV的凡纳滨对虾和健康的对虾的代谢差异。实验内容主要是各取WSSV感染48h后的对虾和注射PBS缓冲液48 h后的健康对虾的肝胰腺组织进行NMR和多元数据分析(包括主成分分析PCA,正交偏最小二乘分析模型OPLS-DA modle),发现与健康对虾相比,WSSV感染的对虾的肝胰腺组织中,醋酸盐、脂质(-CH2-CH=CH-)、赖氨酸、酪氨酸、N-乙酰基糖蛋白的含量很低,而α-葡萄糖和β-葡萄糖的含量则非常高,这表明WSSV感染干扰了对虾对氨基酸的吸收,蛋白代谢以利于病毒复制。本研究结果有助于深入了解病毒致病机制。Part 4:为比较凡纳滨对虾与氧化反应和信号转导相关基因在WSSV感染中的变化情况,本部分实验采用实时荧光定量PCR的技术分析白斑综合征病毒(WSSV)感染凡纳滨对虾6、12、24、48、72五个时间段后鳃和类淋巴组织中硫氧还原蛋白(TRx)、p38信号通路(Lv P38)、过氧化氢酶(CAT)以及过氧化物酶(POD)四种基因在m RNA转录水平的变化。结果表明,感染组对虾的类淋巴组织中TRx、Lv P38、CAT、POD这四种基因在72 h时表达量最高,与对照组形成显著性差异(P<0.05);而在感染组的鳃组织中,该四种基因在12 h时表达量最高,且呈现先升高后下降的趋势;则推断,TRx、Lv P38、CAT、POD这四种基因与WSSV感染密切相关。