乳杆菌为乳制品发酵中的重要菌株,而乳杆菌噬菌体的普遍存在给乳制品行业带来了巨大危害。为有效地对乳杆菌噬菌体进行防治及应用,本文以德氏乳杆菌烈性噬菌体phiLdb和发酵乳杆菌温和噬菌体φPYB5为中心展开研究,具体结果如下：1.德氏乳杆菌烈性噬菌体的分离及性质研究德氏乳杆菌保加利亚亚种Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (L. bulgaricus)为酸奶生产中的重要发酵剂,在奶制品发酵过程中主要负责乳酸的快速积累,产品风味物质的形成,质地的改善等。当L. bulgaricus受噬菌体侵染时,其发酵活性将受到破坏,整个发酵过程迅速减慢或完全终止,从而严重影响产品质量。然而,与乳球菌噬菌体相比,关于乳杆菌噬菌体的研究信息非常有限。本论文从发酵异常的酸奶样品中分离获得一个L. bulgaricus的烈性噬菌体,并命名为phiLdb。该噬菌体具有一个直径大小为47.7±0.9 nm的头部和一条长129.8±2 nm的尾,因此被归为Siphoviridae科。噬菌体phiLdb基因组大小约41 kbp,而且不含粘性末端。该噬菌体的一步生长曲线显示,其潜伏期和裂解期分别为45 min和75min,裂解量为56±2 PFU。噬菌体phiLdb对L. bulgaricus的侵染具高度专一性。二价阳离子Ca2+或Mg2+对促进宿主细胞裂解和提高噬菌斑的形成是必需的。噬菌体phiLdb在pH 2-10的范围内均维持高的存活率,并表现出对乙醇和异丙醇的高耐受性。然而,90℃高温处理40 min可将噬菌体phiLdb彻底灭活。Ca2+,pH及温度对噬菌体phiLdb的吸附影响较弱。另外,噬菌体phiLdb对正常宿主细胞和经灭活处理的细胞的吸附曲线相似,说明宿主细胞的生理状态对该噬菌体吸附影响也不明显。本论文对新分离到的噬菌体phiLdb的各方面性质的研究为生产环境中采用最有效的噬菌体防治策略奠定了理论基础。2.噬菌体保存方法研究噬菌体是专性活细菌细胞内寄生的病毒,离开宿主易于死亡。为长期保存噬菌体,本论文以大肠杆菌λ噬菌体和德氏乳杆菌噬菌体phiLdb为实验材料,分别在不同稳定剂和不同温度下保存6个月,检测期间噬菌体的存活性,探索最有效的保存方法。结果显示,保存效果最好的稳定剂为甘油,其次为二甲基亚砜,效果最差的稳定剂为脱脂奶粉；效果最好的温度为4℃,其次是-80℃。因此,以甘油或二甲基亚砜为稳定剂,置于4℃,-20℃或-80℃保存均为比较简便有效的噬菌体保存方法。3.德氏乳杆菌抗噬菌体菌株的选育及性质研究噬菌体侵染造成的巨大损失促使许多噬菌体防治策略的提出及应用。然而,噬菌体抗性菌株通常是通过DNA重组或携带噬菌体抗性基因的质粒的转移获得的,因而赋予所得菌株潜在的安全隐患。而自发突变的方法,由于不涉及基因操作,已被认为是一种简便有效且“天然”的获得抗噬菌体菌株的策略。60Co-γ射线是最常用的物理诱变剂之一,并且60Co-γ射线诱变已成功用于微生物菌种的改造。本论文通过自发突变及60Co-γ射线辐照诱变的方式分别获得30株抗噬菌体的L. bulgaricus突变株。所有60株突变株均表现出对噬菌体phiLdb的完全抗性(EOP<10-9)。溶源性测定结果表明,除2株自发突变获得的抗性菌株外,其他58株突变菌株的噬菌体抗性均与溶源性无关。所有抗性菌株对噬菌体phiLdb的吸附率明显下降,说明突变菌株可干扰噬菌体的吸附。实验证明,噬菌体phiLdb的吸附受体与肽聚糖-多糖的附属聚合物有关。自发突变获得的抗性菌株间的蛋白酶活性差别较显著,但是大多数抗性菌株的蛋白酶活性及pH值与初始菌株L.bulgaricus ATCC11842的类似。根据各抗性菌株的蛋白酶活性与pH值,我们以BIM 10和γ19为代表,进行发酵乳试验。两株抗性菌株不管噬菌体phiLdb的存在与否,均表现出良好的发酵特性。因此,除自发突变方法外,60Co-γ射线辐照诱变也被证明是一种获得发酵性能优良的Lactobacillus delbrueckii抗噬菌体菌株的简便有效方法。此外,本研究为工业生产中提供了大量抗噬菌体德氏乳杆菌,可作为替换受噬菌体感染发酵剂的后备资源。4.可控性自裂解乳球菌的构建在复制周期的最后一步,噬菌体将产生一系列酶类来裂解宿主细胞,从而释放子代颗粒。所有双链DNA噬菌体编码的裂解相关酶类均涉及两个蛋白,即穿孔素(holin)和裂解素(lysin),组成了“两组分裂解盒”。对发酵乳杆菌温和噬菌体φPYB5的基因组进行测序过程中获得了其“两组分裂解盒”的基因：holin (hyb5)和lysin(lyb5)。为阐明噬菌体φPYB5编码的由穿孔素(Hyb5)和裂解素(Lyb5)组成的裂解盒在乳酸菌中的作用特征,并有效利用该裂解盒构建可控性自裂解的乳酸菌株,我们将基因hyb5-lyb5克隆到E. coli/L. lactis穿梭质粒pSEC的nisin诱导型启动子下游,构建了重组质粒pSEC-hyb5-lyb5。将pSEC-hyb5-lyb5电转入Lactococcus lactis NZ9000,获得重组菌株NZphl。经nisin诱导后,Hyb5-Lyb5的表达表现出高的裂解活性,使NZphl菌液的浊度(OD600)急剧下降,并释放出大量胞内蛋白,为利用自裂解菌株生产优质乳制品奠定了基础。5.发酵乳杆菌温和噬菌体裂解盒在大肠杆菌中的克隆与表达与其他裂解盒不同,Hyb5经预测只含有一个跨膜区,且Lyb5具有N-端信号肽。为研究该组合奇特的裂解盒的作用特征,并阐明Lyb5作为诊疗剂的潜在应用,本论文中,将hyb5, lyb5及hyb5-lyb5分别插入大肠杆菌表达载体,实现了Hyb5,Lyb5在大肠杆菌中的单独表达和共表达。SDS-PAGE结果显示,Hyb5的分子量大小约19 kDa, Lyb5大小为45 kDa。Hyb5或Lyb5的单独表达均可引起宿主菌的裂解,导致胞内β-galactosidase的释放。然而,Hyb5-Lyb5裂解盒的共表达则使宿主菌裂解地更迅速,更彻底。双层平板观测法及zymogram复性胶检测确定了Lyb5对宿主菌的胞外裂解活性。经zymogram复性胶分析,Lyb5展现出非常广泛的裂解谱,可裂解包括致病菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)在内的所有测试革兰氏阳性菌及部分革兰氏阴性菌如沙门氏菌(Salmonella typhi)等,显示出Lyb5作为诊断工具及治疗剂的巨大潜力。6. Hyb5-Lyb5裂解机制初步研究基于大肠杆菌噬菌体的研究结果,holin-lysin裂解盒的裂解作用模型及holin控制裂解时间的机制已有报道。但对侵染其他菌的噬菌体的裂解机制研究比较缺乏。本论文试图通过对Lyb5蛋白N-端信号肽的功能分析及对hyb5不同基因片段的表达和活性分析来阐明Hyb5-Lyb5裂解作用模型及单次跨膜Hyb5控制裂解时间的作用机制。我们将lyb5或△SARlyb5(除掉N端SAR序列的lyb5)插入载体pETDuet-1的多克隆位点1,将hyb5, hyb5p(hyb5 5’端324 bp基因片段)或hyb5N30(编码Hyb5 N-端跨膜区30个氨基酸的序列)插入载体pETDuet-1的多克隆位点2,构建了一系列重组载体。并实现了各基因的单独表达及不同基因间的共表达,观察宿主菌的裂解情况。结果显示,△SARlyb5与Hyb5p的共表达使宿主菌的OD值明显下降,而△SARlyb5的单独表达反而使宿主菌生长更旺盛,说明SAR序列可作为信号肽引导Lyb5穿膜,但Lyb5的裂解活性不依赖于SAR序列。Hyb5的N-端跨膜区单独表达时抑制了宿主菌的生长,表明Hyb5的N-端30个氨基酸可以完成跨膜功能,表现出对细胞的毒性。而N30hyb5与Lyb5或△SARlyb5的共表达并未引起宿主菌的大量裂解,暴露了N30hyb5辅助Lyb5或△SARlyb5穿膜功能的缺陷性。比较有趣的是,缺少C-端46个氨基酸的Hyb5对Lyb5穿膜的促进作用明显高于Hyb5,暗示了Hyb5 C-端序列对其行使运输活性的调节作用。至于SAR在裂解过程中是否被切割以及Hyb5作用时本身及其他调节因素的阐明,以致最后总结出Hyb5-Lyb5奇特组合的裂解机制模型和像Hyb5这样不具备其他Holin具有的典型的双翻译起始位点且仅具一个跨膜区的蛋白控制裂解时间机制模型的提出均需要大量的进一步的实验摸索,推测及证实。