蛋白质是生命现象的主要承载者，是存在最广泛、最丰富的生物大分子。在生理条件下，不同的氨基酸序列能够折叠成特定的三维结构，早在上世纪四十年代，人们就已经利用X射线单晶衍射的方法得到了一些蛋白质分子的三维结构。由于X射线单晶衍射得到的结构是静止的，所以蛋白质分子给人的最初的印象是单一的、刚性的。随着蛋白质结构测定技术的日益成熟，人们逐渐发现对于同一个蛋白质分子在不同晶体环境中得到的结构往往处于不同的构象，而这些构象之间具有大幅度的变化，逐渐认识到蛋白质分子的构象变化对于其生物学功能的重要性。这种现象用物理学家的语言来描述就是蛋白质分子作为一种软物质，是一个由不同构象组成的庞大系综，可以用多维势能面较直观的描述，势能面可以给出每个构象的相对分布情况（热力学）和构象之间转换的能垒（动力学）。晶体结构只是蛋白质势能面上的一个点，要全面理解蛋白质的功能和揭示生理过程的分子机制，我们不但需要了解蛋白质的静态结构，更需要了解蛋白质结构的柔性和各构象之间的转换，即其动态特性。因此需要在传统的结构生物学研究中加入第四个维度，即时间，这样就将结构-功能关系扩展到结构-动力学-功能关系的研究。　　蛋白质分子的构象变化在空间和时间尺度上分布很广，从快速的局部原子振动、侧链转动到慢速的大幅度的结构域的整体运动、蛋白质折叠、变构效应、蛋白质变性。研究蛋白质分子构象变化的实验手段有很多，如X射线单晶衍射、核磁共振（NMR）、荧光共振能量转移(FRET)、圆二色光谱(CD)、红外光谱、拉曼光谱、电子顺磁共振等。和实验手段相比，计算机模拟方法在研究蛋白质动力学方面具有独特的优势。它可以在原子尺度上对蛋白质分子进行详细微观研究，跟踪体系中每一个原子随时间的自然演化过程以预测其性质，给出蛋白质、核酸等生物大分子内部运动的最详实的结果，直接在原子尺度上提供蛋白质分子和其他生物大分子的动态信息并且可以以此推测动态运动与生物功能之间的关系。这些都是实验中很难甚至无法达到的。目前由于计算机计算能力、并行效率以及计算精度的限制，对于μs～ms级的构象变化是很难用普通的全原子的分子动力学模拟的。为了克服这一困难，计算生物学家发展了多种方法和策略来简化力场或施加外力以加速构象变化的演化过程。　　本论文中我们的研究体系是AcrAB-TolC多重耐药性外排泵，希望通过计算机模拟的方法研究其构象变化的动力学，增强对其作用机理的认识，揭示其作用过程的分子机理，为药物的研制、疾病的治疗提供更多的信息和理论基础。　　多重耐药性是导致抗感染药物治疗和肿瘤化疗失败的重要原因之一，可以对结构和功能上迥异的多种药物或对其有毒的代谢产物同时表现出耐受性。多重耐药性主要是由细菌或肿瘤细胞膜上多重耐药泵产生的，广泛存在于自然界中，在革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真核细胞中都可见到。已发现与多重耐药性转运蛋白相关的蛋白超家族主要有5个:ABC(ATP binding cassette)超家族、RND(resistance nodulation division)超家族、MF S(major facilitator superfamily)超家族、MATE(the multidrug and toxic-compound extrusion)超家族、SMR(smallmultidrug resistance)超家族。其中，RND蛋白在真核和原核细胞中都存在，是一种继发性主动转运蛋白，由质子顺电化学梯度的跨膜运动提供能量。目前RND蛋白中研究比较多、比较清楚的体系是来自于大肠杆菌的AcrB蛋白，是大肠杆菌产生多重耐药性最重要的蛋白之一。　　AcrB在发挥其生物功能时需要两个帮手:膜融合蛋白AcrA和外膜通道蛋白TolC，这三个蛋白组合成一个转运复合物AcrAB-TolC。在这个AcrAB-TolC多重耐药性转运体系中，AcrB位于细胞内膜，其主要功能是通过质子顺电化学梯度的跨膜运动（从细胞周质到细胞质）为整个体系提供能量，以及筛选由细胞质或细胞周质进入的分子，将筛选出的底物分子传递给TolC; TolC位于细胞外膜，将底物分子转运到细胞外;AcrA位于细胞周质中，与AcrB，TolC都有相互作用，对于整个体系的转运功能必不可少，但其具体作用机理尚不清楚。　　通过X射线单晶衍射得到的三维结构显示AcrB以三聚体的形式存在。其中三个单体处于三个不同的构象，即:进入状态（A态），结合状态(B态）和排出状态(E态）。这三个连续的状态似乎暗示了AcrB在转运底物时构象变化的机理可能是三态依次循环(three-step functionally rotating mechanism)，即A→B→E→A的构象依次变化的机理。一些结构和生化实验的结果在一定程度上支持这一机理，但是都无法直接证实，而且目前关于AcrB的转运机理还有很多问题亟待解释。我们首先对AcrB体系做了常规分子动力学模拟，结果表明在AcrB三聚体中PD结构域，尤其是其中PC2子结构域的构象运动比较明显;另外我们还发现在B单体结合口袋有底物结合的情况下，质子化状态D407HD408H(E)晶体结构在50ns的模拟中比较稳定。但是通过普通分子动力学模拟很难完成AcrB的功能性构象转换，我们随后采用了正则模式分析和靶向分子动力学模拟方法对AcrB进行了研究。发现单体低频模式中以PD结构域的运动为主，而且低频模式对构象转换都有较大的贡献。AcrB三聚体的正则模式分析表明单体内PD结构域与TMD结构域之间的构象耦合很弱，但是单体之间却有明显的构象耦合，另外不同单体之间的PN结构域相关性较强。靶向分子动力学模拟揭示的整个构象转换(ABE→BEA)过程是从A→B构象变化中PN2子结构域的构象运动开始的，通过三个单体PN子结构域之间的构象耦合传递到B和E单体;而PD结构域，尤其是PC2子结构域的内在构象柔性可能为随后的构象变化提供了熵驱动力，推动整个转运循环。我们发现底物的转运和质子转运路径的构象变化都是在PD结构域中的整体构象运动结束后才开始的，因此质子转运路径中局部残基侧链的构象变化可能是底物转运的决速步骤。　　底物离开AcrB之后，通过TolC外膜蛋白，排到细胞外。TolC外膜蛋白是一个跨膜孔道蛋白，在其晶体结构的构象中，TolC的细胞外端和细胞周质端都处于关闭状态，有两个门径:细胞外门径(EG)和细胞周质端门径(PG）。细胞外门径是由三个无规线团(loop)组成的，细胞周质端门径则是由向内弯曲的α-螺旋束形成的，在入口端的氢键和盐桥网络使其处于闭合状态。为了了解药物分子通过TolC孔道的自由能途径，我们计算了钠离子和阿霉素(doxorubicin，DOX)沿着TolC孔道中轴线坐标的平均力势(Potential of Mean Force，PMF)，发现阿霉素和钠离子通过时，TolC的细胞周质端门径(PG)的打开都会发生，而且其打开是由底物决定的。但是这个区域的构象变化并不会导致钠离子通过时的能垒。细胞外无规线团和残基Lys283会导致钠离子的渗透能垒，但是由于阿霉素与蛋白之间广泛的相互作用，阿霉素在这个区域内并没有能垒。TolC在钠离子通过时具有较高的构象柔性，但是阿霉素似乎可以稳定其关闭构象。AcrB的存在并不能帮助TolC打开其细胞周质端门径，而TolC细胞周质端门径的打开会引起TolC-AcrB复合物的解体。为了采样到TolC构象空间中更多处于打开状态的构象，我们做了各种突变体的分子动力学模拟，发现采样空间中的大部分构象都是不对称的，但是打开程度最大的构象（完全打开构象）却是对称的。我们还通过靶向分子动力学模拟方法模拟了由关闭状态到打开状态的全过程，发现打开过程中呈现不对称构象。　　AcrAB-TolC体系的另一个组成部分是膜融合蛋白AcrA，它是一个镰刀型、拉长结构的分子，包含四个结构域:α螺旋发卡结构域(α-hairpin domain)、硫辛结构域(lipoyl domain)、β桶结构域(β-barrel domain)，和近膜结构域(membraneproximal(MP) domain)。目前AcrA蛋白在AcrAB-TolC体系中行使其功能的作用机理还不清楚。AcrA的晶体结构只得到了部分结构域的结构，缺少N端和C端，而且还引入了四个突变。功能实验表明缺少C端的AcrA和引入四个突变的AcrA对很多底物的耐药性都消失了。结构研究和顺磁共振(EPR)实验都显示AcrA具有很高的构象柔性，而且pH可以诱导构象变化。我们以MexA为模板通过同源建模构建了AcrA的完整结构，在不同pH值的条件下做了全原子分子动力学模拟，结果表明两个模型的结构域内部都很稳定，构象柔性主要来自于α-hairpin和MP结构域的整体构象运动。AcrA的构象对局部突变和pH值都很敏感。与EPR实验结果一致，我们发现将pH值由7.0降低到5.0会限制AcrA结构域之间的构象运动，而His285的质子化状态会改变局部的氢键相互作用，调节pH引起的构象变化。基于AcrB、TolC的晶体结构和AcrA的完整结构模型，我们通过分子对接得到了AcrAB-TolC复合物的结构模型，并对该模型做了正则模式分析，结果表明在AcrB和TolC没有直接接触的结构之间也会有构象的耦合，而AcrA的加入会显著增强AcrB和TolC的构象耦合。　　我们对AcrAB-TolC多重耐药性外排泵体系的构象柔性和底物转运机理进行了系统和全面的研究，在原子水平上提供了底物转运过程中AcrAB-TolC构象变化的一些重要特征，可以为以后实验工作者的实验设计和疾病治疗提供思路和理论支持。此外，也能够进一步丰富大型蛋白质体系的计算模拟方法和手段，为深入了解蛋白质分子结构、构象变化规律及其与生物功能的关系提供更丰富的信息。随着计算机运算能力的发展和算法的进一步优化，计算模拟在蛋白质分子构象变化研究中的作用必将更为强大，而模拟与实验的结合也将能更深入地揭示生命的奥秘。