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目的:阐明清肺通络膏组方的理论基础及穴位贴敷的应用理论;采用流感病毒(IV)诱导大鼠肺炎模型,探讨IV导致大鼠肺炎的发病机制;研究清肺通络膏对IV诱导的MAPKs信号传导通路的调控作用及其高、中、低剂量干预IV肺炎大鼠MAPKs信号通路时效、量效性关系,为临床防治IV肺炎提供实验依据。采用高效液相色谱法(HPLC)测定清肺通络膏中药物含量,以明确其治疗IV肺炎物质基础。材料与方法:1.采用鼻腔接种甲型流感病毒鼠肺适应株法诱导幼龄Wistar大鼠肺炎模型,结合大鼠一般状态、肺组织病理切片、形态学等指标,观察正常组和模型组大鼠各方面的差异,并应用Realtime-PCR技术检测大鼠肺组织中不同时间点的病毒载量基因水平,从多个角度进行模型评价。2.将清肺通络膏外敷在幼龄大鼠背部(等同于外敷在大鼠的肺腧等穴位)作为给药的途径对IV诱导的肺炎大鼠模型进行干预,在不同时点对各组大鼠的一般状态、体重及肺指数的差异进行比较研究。3.采用免疫组化法和RT-PCR技术检测IV诱导肺炎大鼠的肺组织中P38、JNK和MKK4的蛋白及m RNA的表达,探讨清肺通络膏对IV肺炎幼龄大鼠的防治作用机制,同时比较研究清肺通络膏高、中、低剂量组干预IV肺炎大鼠MAPKs信号通路不同时点活化程度的差异性。4.应用HPLC法测定清肺通络膏中大黄和黄芩的六种活性成分含量。结果:1.各组大鼠体重比较结果:正常组大鼠的体重呈逐日增长趋势;模型组大鼠体重增加与正常组比较略为缓慢,感染第2天以后与同时间点的正常组日增长体重比较,有显著性差异(P<0.05);第3天大鼠体重增长幅度有所升高,治疗组体重逐日增加,增长略慢于正常组,与模型组同时间点比较,具有显著性差异(P<0.05);相比于同时间点的低剂量组,高剂量组体重增长具有显著性差异(P<0.05);中剂量组体重增长具有显著性差异(P<0.05)。2.IV感染后肺部病理改变结果:光镜下观察各组大鼠肺脏病理组织学变化。造模后第5天,正常组大鼠在任何时点肺组织外观全肺野无病变。模型组大鼠肺组织可见上皮细胞有破损,细支气管壁细胞侵润、充血、水肿,并向周围支气管组织扩展。肺泡壁增厚,部分可见坏死,由大量红细胞、单核细胞核巨噬细胞等组成的水肿液填充肺泡。病变较重的部位可见肺毛细血管的透明栓塞和坏死。3.肺组织不同时点IV-RNA的半定量测定结果:实时采用RT-PCR,正常组大鼠各时间点肺组织中未检测到IV病毒核酸。在大鼠感染3~7天的模型组大鼠肺组织中发现IV-RNA扩增表达,表达随着病毒载量的增加而增加,提示病毒的感染量同炎症的损伤成正比规律。4.肺指数结果:相比于正常组,模型组大鼠肺指数明显升高,具有显著性差异(P<0.05);高、中、低剂量组相比于模型组,肺指数均有所降低,具有显著性差异(P<0.05);高剂量组相比中、低剂量组,肺指数下降的更明显;高剂量组虽有下降,但比正常组要高,与正常组具有显著性差异(P<0.05)。5.各组大鼠肺组织中P38蛋白表达情况正常组可以在各个时间点可检测少量的P38蛋白表达,比较均无显著性差异(P>0.05);模型组P38蛋白的表达最强,第7天积分光密度值达到高峰,为18.720±1.254;与同时间点的正常组比较,均具显著性差异(P<0.05);高剂量组与同时间点的模型组相比,第3、5、7天均有显著性差异(P<0.05)。高剂量组P38蛋白表达不同时点均高于正常组、低于模型组(P<0.05);高剂量组与中剂量组比较,第7天有显著性差异(P<0.05)。6.各组大鼠肺组织中JNK蛋白表达情况正常组可以在各个时间点可检测少量的JNK蛋白表达,比较均无显著性差异(P>0.05);模型组JNK蛋白的表达最强,第7天积分光密度值达到高峰,为35.839±4.929;与同时间点的正常组比较,均具显著性差异(P<0.05);高剂量组与同时间点的模型组相比,第3、5、7天均有显著性差异(P<0.05)。高剂量组JNK蛋白表达不同时点均高于正常组、低于模型组(P<0.05)。7.各组大鼠肺组织中MKK4蛋白表达情况正常组可以在各个时间点可检测少量的MKK4蛋白表达,比较均无显著性差异(P>0.05);模型组MKK4蛋白的表达最强,第7天积分光密度值达到高峰,为20.806±1.662;与同时间点的正常组比较,均具显著性差异(P<0.05);高剂量组与同时间点的模型组相比,第3、5、7天均有显著性差异(P<0.05)。高剂量组MKK4蛋白表达不同时点均高于正常组、低于模型组(P<0.05);高剂量组与中剂量组比较,第7天有显著性差异(P<0.05)。8.各组大鼠肺组织中P38与MKK4蛋白表达的相关性分析采用直线相关分析方法,实验各组的P38、MKK4蛋白表达的相关性r值均接近于1。除第3天敷胸膏高剂量组外,其余各实验组在各时间点P38与MKK4的蛋白表达的变化存在正相关(P<0.05)。9.各组大鼠肺组织中JNK与MKK4蛋白表达的相关性分析采用直线相关分析方法,实验各组的JNK、MKK4蛋白表达的相关性r值均接近于1。除第3天敷胸膏中剂量组、第5天正常组、第7天正常组外,其余各实验组在各时间点JNK与MKK4的蛋白表达的变化存在正相关(P<0.05)。10.各组大鼠肺组织中P38 mRNA不同时点的表达水平正常组可以在各个时间点可检测少量的P38 m RNA表达,比较均无显著性差异(P>0.05);不同时点的模型组大鼠P38 m RNA的表达明显高于正常组,具有显著性差异,第7天表达最强;高剂量组与同时间点的模型组相比,不同时间点P38 m RNA表达水平明显降低,但仍高于正常组(P<0.05)。高剂量组与中剂量组比较,第3天和第5天有显著性差异(P<0.05)。11.各组大鼠肺组织中JNK m RNA不同时点的表达水平正常组可以在各个时间点可检测少量的JNK m RNA表达,比较均无显著性差异(P>0.05);不同时点的模型组大鼠JNK m RNA的表达明显高于正常组,具有显著性差异,第7天表达最强;高剂量组与同时间点的模型组相比,不同时间点JNK m RNA表达水平明显降低,但仍高于正常组(P<0.05)。高剂量组与中剂量组比较,第7天有显著性差异(P<0.05)。12.各组大鼠肺组织中MKK4 m RNA不同时点的表达水平正常组可以在各个时间点可检测少量的MKK4 m RNA表达,比较均无显著性差异(P>0.05);不同时点的模型组大鼠MKK4 m RNA的表达明显高于正常组,具有显著性差异,第7天表达最强;高剂量组与同时间点的模型组相比,不同时间点MKK4 m RNA表达水平明显降低,但仍高于正常组(P<0.05)。13.各组大鼠肺组织中P38与MKK4 m RNA表达的相关性分析采用直线相关分析方法,实验各组的P38、MKK4 m RNA表达的相关性r值均接近于1。除第3天敷胸膏低剂量组、第7天模型组、敷胸膏高剂量和中剂量组外,其余各实验组在各时间点P38与MKK4 m RNA表达的变化存在正相关(P<0.05)。14.各组大鼠肺组织中JNK与MKK4 m RNA表达的相关性分析采用直线相关分析方法,实验各组的JNK、MKK4 m RNA表达的相关性r值均接近于1。除第3天正常组、模型组、敷胸膏中剂量组,第7天模型组、敷胸膏中剂量组外,其余各实验组在各时间点JNK与MKK4 m RNA表达的变化存在正相关(P<0.05)。结论:1.通过观察大鼠一般状态、光镜下肺组织病理及实时荧光定量法检测肺组织中IV病毒载量,验证乙醚麻醉下滴鼻接种15LD50甲型流感病毒FM1株0.1ml,可以成功建立IV感染Wistar大鼠幼龄鼠肺炎模型。2.清肺通络膏能明显减轻IV感染肺炎大鼠的一般状态及肺组织炎症损伤,改善大鼠肺组织病理和肺指数。其治疗作用与抑制IV感染大鼠肺组织P38/JNK MAPK信号通路的过度活化有关。其中高、中剂量组在病变过程中第3、5、7天对P38、JNK、MKK4表达的抑制作用优于低剂量组。3.建立了清肺通络膏中6种有效成分的HPLC测定方法,通过验证该方法稳定、可靠、灵敏度高、重复性好,可作为清肺通络膏质量控制及含量测定的方法。