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目的构建结核杆菌嵌合蛋白Ag856A2的原核表达载体,进行原核表达、纯化和抗原性分析,制备该蛋白的单克隆抗体,并鉴定单抗的重要性质。方法以DNA疫苗HG856A为模板,经PCR扩增获得ag856a2基因,克隆至pET28a质粒得到原核表达质粒pET856A2;用该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导目的基因表达,通过SDS-PAGE鉴定其表达形式;用Ni2+柱亲和层析纯化嵌合蛋白Ag856A2;分别用Ag85A及ESAT-6的小鼠抗血清对纯化的蛋白Ag856A2进行Western Blotting分析其抗原性。用DNA疫苗HG856A和纯化的嵌合蛋白Ag856A2免疫BALB/C小鼠,取脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0融合,通过HAT培养基选择性培养,间接ELISA法筛选阳性克隆,用有限稀释法将阳性克隆单克隆化,再用间接ELISA法筛选、鉴定,最终建立稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株;分别用间接ELISA法鉴定单克隆抗体的亚类、效价及所识别的抗原,用Western Blotting分析识别蛋白ESAT-6的单克隆抗体的特异性。结果成功构建了重组质粒pET856A2,嵌合蛋白Ag856A2以包涵体形式表达,约占菌体总蛋白的35%;经Ni2+柱亲和纯化的样品SDS-PAGE分析纯度在90%以上,Ag85A及ESAT-6抗血清均可与其发生特异性反应。融合后经筛选、克隆化得到6株抗Ag856A2的杂交瘤细胞,经鉴定有五株可同时与蛋白Ag856A2、Ag85A反应,为IgG1亚类;一株可同时与蛋白Ag856A2、ESAT-6反应,为IgG2b亚类,其培养上清与蛋白ESAT-6反应效价为6400,与蛋白Ag856A2反应效价为12800;该株单克隆抗体经Western Blotting鉴定可与蛋白Ag856A2、ESAT-6发生特异性反应。结论以包涵体形式表达的嵌合蛋白Ag856A2具有Ag85A及ESAT-6的抗原性;以其DNA疫苗和纯化蛋白免疫小鼠后,初步建立起一株分泌抗蛋白ESAT-6单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本研究为进一步研究该嵌合蛋白在结核病亚单位疫苗中的应用打下了基础,为抗蛋白ESAT-6单克隆抗体在结核病早期诊断上的应用奠定了基础。