骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cells, BMSCs）是存在于骨髓中除造血干细胞外的另一种干细胞，能够自我复制、自我更新并具有多向分化潜能。其具有取材方便、易于分离和体外培养扩增，免疫原性低，能分化为心肌细胞，内皮细胞和血管平滑肌细胞等诸多优势，成为治疗心脏疾患极有前景的种子细胞。但因其来源较少使其用于临床受限制，且BMSCs需要一定外源因素的作用才能分化为其他细胞。因此，本实验用丹参酮ⅡA磺酸钠（sodium tanshinonⅡA silate，DS-201)对BMSCs进行干预，观察其对BMSCs的增殖情况及诱导BMSCs向心肌样细胞分化的作用。　　研究目的：　　1、研究SD大鼠BMSCs的体外分离、纯化和扩增，建立成熟而稳定的BMSCs培养体系，为后续的实验研究提供充足的细胞来源。　　2、研究丹参酮ⅡA磺酸钠对BMSCs增殖的作用。找到DS-201促进BMSCs增殖的最适宜浓度。并用此浓度连续干预，检测此浓度对BMSCs的生长增殖趋势的影响。　　3、研究丹参酮ⅡA磺酸钠在BMSCs向心肌样细胞分化过程中的作用。并将其作用与5-aza诱导作用相比较。　　研究方法：　　1、BMSCs的体外分离、纯化、扩增和鉴定。采用全骨髓贴壁筛选法分离培养SD大鼠的BMSCs，用免疫荧光染色法检测BMSCs表面蛋白标志CD29、CD34、CD44抗原的表达情况，以鉴定BMSCs和判断BMSCs的纯化效果。选取P1、P2、P3、P4、P5五代细胞分别用MTT法进行24h、48h、72h、96h、120h五个不同时间点的吸光度值测定，以描述细胞的生长情况，并绘制生长曲线。　　2、DS-201对BMSCs增殖的影响。选DS-2018个不同浓度组对P3代BMSCs进行干预，每组5个复孔，干预24h后用MTT法测各组细胞的吸光度，选取24h内对BMSCs增殖最适宜的浓度，继续对BMSCs干预3天，将此浓度组在24h、48h、72h、96h四个不同时间点测得吸光度值进行统计。　　3、DS-201诱导 BMSCs向心肌样细胞分化的作用。用5-氮杂胞嘧啶核苷（5-azacytidine,5-aza）诱导组、单纯DS-201组及两者联合干预组对BMSCs进行诱导，通过RT-PCR方法检测诱导后BMSCs的SDF-1、αMHC、βMHC基因的表达来比较几种诱导方法的效果。　　结果：　　1、BMSCs原代取材后48h首次换液，3天后细胞进入对数生长期，增殖迅速，形态为长梭形。原代9～10天细胞可铺满瓶底，呈放射状或漩涡状。传代后的细胞较快贴壁，迅速进入生长期，5天左右即可进行下一次传代。随着代数的增加，其他非BMSCs细胞逐渐减少，传代至第3代细胞时，细胞已比较纯化。取第3代细胞进行鉴定，用免疫荧光染色法检测表面蛋白标志 CD29（BMSCs细胞表面标志）、CD34（造血干细胞及内皮细胞表面标志）、CD44（BMSCs表面标志），结果为 CD29、CD44为阳性，CD34为阴性。从生长曲线上可以看出：P1代细胞前72h为细胞生长潜伏期，96h后细胞进入快速增长期。而P2～P5代细胞增殖趋势较稳定，从传代24h即进入增长期，只是传代次数增多，细胞增殖速度降低。　　2、DS-201干预BMSCs生长24h时，与对照组比较，浓度1组（1.5×103umol/L）对 BMSCs增殖有明显的抑制作用，而其他浓度组则均有促进增殖作用，其中浓度6组（1.5×10-2umol/L）促增殖作用最大。因此选用 DS-201浓度6组作为最适浓度进行后续实验。但随干预时间的延长，细胞增殖率越来越低。　　3、RT-PCR方法检测诱导后BMSCs的SDF-1、αMHC、βMHC基因的表达，发现5-aza与DS-201联合诱导BMSCs比单纯DS-201或单纯5-aza诱导效果有明显的优势。　　结论：　　1、本研究建立了成熟的SD大鼠BMSCs的体外培养方法，细胞增殖迅速，状态良好，生物学性质稳定，无过多的非BMSCs的干扰，综合细胞形态、细胞表面蛋白标志鉴定及生长曲线的结果可以确定培养细胞为BMSCs。　　2、DS-201对BMSCs的增殖作用与DS-201的浓度有关，高浓度对细胞生长有抑制作用，而浓度适宜则促进增殖。DS-201对 BMSCs促增殖最适宜浓度为1.5×10-2umol/L。　　3、本研究证明了DS-201可诱导BMSCs向心肌样细胞方向分化，5-aza与DS-201联合诱导BMSCs的效果比单纯DS-201和单纯5-aza诱导效果均有明显的优势。此结果可能与DS-201可降低5-aza本身的毒性有关，两者联合应用BMSCs的分化效果更好。