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研究背景:心肌重构包括心肌细胞重构与胞外基质重构,是各种心脏病发展为心力衰竭过程中的关键环节。研究表明,细胞外基质处于活跃的代谢状态,并且积极地参与细胞内外信息传递与心脏结构和功能的维护。心肌细胞外胶原纤维网主要包含Ⅰ、Ⅲ型胶原,在正常生理条件下处于合成与降解的相对稳态,这种平衡的维持主要与心脏成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成分泌与参与胶原降解的基质金属蛋白酶(MMPs)对胶原的降解基本保持一致有关,金属蛋白酶组织抑制物(TIMPs)对MMPs的活性具有抑制作用,在ECM的代谢过程中也发挥了重要作用。在血管紧张素Ⅱ刺激下,可出现成纤维细胞的病理性增生,胶原合成增加以及MMPs/TIMPs活性改变造成的胶原降解的下降,从而使心肌细胞外基质的降解与合成平衡被打破,导致胶原沉积,进而引起细胞外基质重构,最终导致心肌僵硬度增加,心脏舒张及收缩功能受损。因此抑制心脏成纤维细胞的增殖及胶原表达,防止胶原的沉积是预防和治疗心肌细胞外基质增生重构的主要目标。PTEN(10号染色体上缺失的磷酸酶与张力蛋白同源物)是一种肿瘤抑制因子,负性调控PI3K/Akt信号通路,参与了细胞增殖、生长、分化、定向运动和凋亡等多种生物过程,对细胞外基质合成与降解也具有调控作用。在肿瘤细胞中PTEN过度表达可导致细胞周期阻滞,抑制细胞增殖,同时抑制MMPs表达,细胞外基质降解减少,从而抑制肿瘤转移。但在原发性肺间质纤维化的研究中则发现,PTEN过度表达将减轻纤维化程度。这说明PTEN有可能抑制组织纤维化,其机制与抑制肿瘤细胞转移不尽相同。因此可以推测PTEN的过度表达将有可能抑制心脏间质纤维化,但目前尚未见这方面的研究报道。本实验探讨PTEN过度表达对血管紧张素Ⅱ刺激所致心脏成纤维细胞增殖及胶原合成与降解的影响,以期进一步了解PTEN在心肌细胞外基质重构中的作用及其机制。研究方法:1.鉴定并通过反复感染293细胞,扩增携带野生型PTEN基因的腺病毒载体(Ad-PTEN),以及G129E(丧失了脂质磷酸酶活性,仅保留蛋白磷酸酶活性的PTEN突变体)基因的腺病毒载体(Ad-G129E)。2.通过病毒感染构建过度表达PTEN或G129E的心脏成纤维细胞模型,通过追踪绿色荧光蛋白(GFP)的表达,检测不同感染倍数(M.O.I.)的感染效率,以及感染后24h,48h和72h时GFP表达阳性率,确定合适的感染倍数和病毒表达时间。3.用RT-PCR和Western Blot检测受感染细胞内PTEN或G129E的mRNA和蛋白表达,检测通过腺病毒感染介导能否有效地引起心脏成纤维细胞内过度表达PTEN或G129E。4.用AngⅡ作为促心脏成纤维细胞分裂增殖及胶原合成的刺激剂,观察PTEN或G129E过度表达对心脏成纤维细胞分裂增殖及胶原合成的影响,Ⅰ、Ⅲ型胶原,MMP-2,TIMP-1,TGF-β1作为胶原合成与降解的指标,仅携带GFP的空病毒(Ad-GFP)作为对照。5.流式细胞仪检测细胞周期,AO/EB法检测细胞凋亡。6.RT-PCR检测Ⅰ、Ⅲ型胶原,MMP-2,TIMP-1,TGF-β1表达,Western Blot检测Akt、P27蛋白表达,3H-脯氨酸掺入法检测胶原合成率,明胶酶谱法检测明胶酶活性。结果:1.鉴定已构建好的Ad-PTEN及AD-G129E病毒载体,通过反复感染293细胞,通过反复感染AD293包装细胞,腺病毒得到扩增,获得较高滴度的病毒液。2.Ad-G129E的转染将引起心脏成纤维细胞失巢性凋亡。3.Ad-PTEN和Ad-GFP感染心脏成纤维细胞后,GFP表达阳性率随着M.O.I.和时间增加而增加;M.O.I.达到100以上时,细胞GFP阳性率达到90%以上;各种M.O.I.感染48h后,GFP阳性表达趋于稳定,因此确定M.O.I.100感染后48h作为进行后续实验的适宜条件。4.RT-PCR和Western Blot检测显示,携带外源基因PTEN的腺病毒感染后,心脏成纤维细胞内过度表达PTEN的mRNA和蛋白。5.AngⅡ刺激使TGF-β1表达显著升高,抑制PTEN表达,激活PI3K/Akt通路,抑制P27蛋白表达,促使心脏成纤维细胞分裂增殖加速;PTEN过度表达抑制PI3K/Akt通路,促进P27蛋白表达,使心脏成纤维细胞出现细胞周期G1/S期阻滞,从而引起细胞增殖受抑制。6.AngⅡ刺激使Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达及蛋白合成率均显著升高, PTEN过度表达能够抑制AngⅡ刺激所致Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达水平的升高,对Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的合成有显著的抑制作用。7.AngⅡ刺激使MMP-2以及TIMP-1 mRNA表达显著升高,PTEN过度表达时AngⅡ刺激将导致MMP-2 mRNA表达的下降以及TIMP-1mRNA表达水平的升高。8.AngⅡ刺激使心脏成纤维细胞分泌的明胶酶活性显著降低,PTEN过度表达能明显抑制心脏成纤维细胞分泌的明胶酶活性,但在AngⅡ刺激48h后明胶酶活性显著增强,72h后这种增强效应更加显著。结论:AngⅡ刺激促进心脏成纤维细胞TGF-β1表达,从而抑制PTEN表达,PTEN表达的下调解除了对PI3K/Akt信号通路的抑制,引起CDKs抑制因子P27表达下降,促进细胞分裂增殖;PTEN过度表达抑制了PI3K/Akt通路,导致P27表达升高,细胞周期发生G1/S期阻滞,引起细胞增殖受抑;PTEN过度表达抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原基因转录和合成,AngⅡ刺激导致MMP-2转录水平下降以及TIMP-1转录水平的升高;PTEN过度表达能增加AngⅡ刺激后明胶酶活性,这种增强效应呈时间依赖性显著升高。此外,G129E的过度表达将诱导心脏成纤维细胞发生失巢性凋亡,提示PTEN促心脏成纤维细胞的凋亡作用可能与其蛋白磷酸酶活性有关。