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一、重组腺病毒的制备及其对肿瘤细胞、内皮细胞生长的作用 目的：制备高浓度、高纯度携有小鼠内皮抑素基因的重组腺病毒，测定该病毒体外对效应细胞的转染率，明确转染后肿瘤细胞能够表达内皮抑素，观察携有目的基因的重组腺病毒转染后对肿瘤细胞及内皮细胞体外培养时生物学特性变化。 方法和结果： （一） Ad-mEnd和Ad-GFP用293细胞扩增，经氯化铯密度梯度离心法纯化浓缩后，TCID50法测得最终病毒滴度分别为5.01×1010 pfu／ml和3.16×1010pfu／ml；并用Ad-GFP测得本腺病毒对G422细胞的体外转染率，在MOI=100时即可达到90％以上。 （二） Ad-mEnd转染G422细胞培养后，RT-PCR检测到在540bp位置有高亮度条带表达，定量为β-Actin的5倍，测序结果为End基因；在转染细胞的上清液中，Western blot试验方法能够检测到20KD的蛋白质表达，证实End蛋白质表达。 （三） 消化分离法分离和培养G422小鼠胶质母细胞瘤，使之形成单细胞悬液，在高糖DMEM培养液中可存活数代，细胞悬浮生长，不贴壁；差速离心法成功提取脑微血管内皮细胞，细胞贴壁后呈铺路石样生长，在体外长期培养传代。 （四） G422、BMEC、ECV细胞转染Ad-mEnd后，MTT法检测BMEC和ECV的细胞生长抑制率分别为95％和78％，G422组转染Ad-mEnd后细胞生长正常；分别用流式细胞仪测定了不同转染时间后Ad-mEnd对G422、BMEC和ECV凋亡的影响，发现内皮细胞系在24小时内即可出现明显大批细胞凋亡，48小时到60小时达到高峰，细胞周期分析图上可以见到明显的调亡峰，Gl期细胞比率增加;G422细胞在分别转染Ad一mEnd、Ad一GFP、PBS后观察60小时，各时间段均未出现细胞凋亡现象，细胞周期捡测结果显示细胞各期生长正常，无凋亡峰出现。 结论:本实验重组腺病毒经扩增、纯化和浓缩后，Ad一mEnd病毒滴度为5义10’。p创mI，在Mo卜100时，病毒对G422的转染率大于90%;重组腺病毒携带的内皮抑素基因经RT-PCR，W七stem一blot等检测，证实得到有效表达;携有内皮抑素基因的重组腺病毒转染可抑制内皮细胞增殖，促进内皮细胞凋亡，而对G422细胞没有影响，为下一步体内实验打下基础。二、基因治疗荷瘤小鼠胶质母细胞瘤体内转染率测定 目的:测量基因治疗用腺病毒在荷瘤鼠肿瘤体内的转染率，明确本基因治疗最佳病毒注射剂量和病毒注射方法。 方法:荷瘤昆明小鼠195只，用与Ad一mEnd有相同结构和生物学特性的Ad一GFP作为研究对象，按多因素多水平析因分析法分病毒注射量、注射方法和时间3个因素组，共60个水平，各组荷瘤小鼠在肿瘤接受相应处理后组织块用0.25%胰酶消化，细胞悬液稀释后先在荧光显微镜下观察粗筛，阳性细胞样本再用流式细胞仪计数3次，所得数据用SPSS软件包分析。 结果:病毒注射量为MOI二10、50、250、1000时，瘤体内平均转染率分别为16.760%、25.273%、33.820%和35.078%;肿瘤周围注射点分为1、4、8点时，瘤体内平均转染率分别为21.368%、29.947%、31.883%;注射后在第1、3、5、7、10天接受测量，平均转染率分别为14.039%、31 .292%、33.386%、35.964%、23.983%。 结论:病毒注射量、注射方法和时间三个因素共同决定本腺病毒的体内转染率，转染率与各组间不存在有一阶和二阶的交互作用，实验提示当注射病毒量为MO工二250，肿瘤局部分多点（4以上）注射用药，在病毒注射后第7天，检测到的体内转染率最高，可大于45%，同时也是基因治疗的最佳方法。三、Ad一mEnd基因治疗小鼠胶质母细胞瘤抑制血管生成的实验 研究 目的:通过接种转染有Ad一mEnd基因的G422细胞，观察小鼠皮下成瘤的时间和成瘤比率;明确荷瘤小鼠瘤体直接注射Ad一mEnd后对胶质瘤血管生成和肿瘤生长的抑制效果，分析其中的作用机制。 方法:成瘤率研究中，用昆明种小鼠93只，共分为3组，每组31只，分别接种单纯G422细胞，G422+Ad一GFP和G422+Ad一mEnd，每天观察接种部位，接种后20天为截止点计算成瘤小鼠比率，测量肿瘤组织块体积增长速度情况;在小鼠瘤体注射Ad--mEn白研究中，用昆明种G422皮下荷瘤小鼠84只，在成瘤直径大小约3二时分为4组，每组20只，分别为注射空病毒保存液组、八d一GFP组、Ad一mEnd单剂组和Ad一mEnd重复给药组。注射病毒量0.lml/只，在瘤体内分4点注射，End重复给药组每间隔7天，反复注射，其它各组只注射1次相应药液。用常规HE染色病理切片、RT一PCR、电子透射显微镜和免疫组化等方法鉴定肿瘤内的End蛋白表达，测量肿瘤瘤体单位血管密度，观察各组小鼠生存率、生存分析和体积增长，了解肿瘤细胞和内皮细胞的凋亡情况。结果:了.60士1.52/:3（）)，66.单纯G422组、GFP组和End组平均成瘤时间分别为7.56士1 .45天，天和9.15士2.27天，成瘤率分别为100%（30/30），93.33%(2867%（20/30），End组与前两组存在显著差异;荷瘤小鼠瘤体经Ad一mEnd治疗后，大体观上End组肿瘤较小，质硬而韧，而对照组肿瘤较大，仲瘤质地柔软。HE染色后光镜下均可见到典型胶质瘤肿瘤细胞，呈浸润性生长，E。。i实验组有较多结缔组织并血管少，对照组有较多的血管分布