桃蚜浓核病毒基因组特征及表达分析

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2003年,国际上首次从荷兰的桃蚜(Myzus persicae)分离获得桃蚜浓核病毒并测定了该病毒的部分基因组序列。目前,关于桃蚜浓核病毒的进化关系与侵染分子机理所知甚少。在早先获得桃蚜浓核病毒杨凌株系(MpDV-YL)基因组编码序列的基础上,我们又扩增获得了桃蚜浓核病毒云南株系的基因组编码序列(MpDV-YN),并分析了其序列特征及桃蚜浓核病毒进化关系。此外,我们检测了桃蚜浓核病毒在桃蚜及桃蚜寄主植物中的表达和复制情况,研究结果如下:  1、根据已获得的MpDV-YL基因组序列设计重叠PCR引物。采用PCR从采自云南省昆明地区的桃蚜中扩增获得大小为 5483bp 的桃蚜浓核病毒片段。序列分析表明,该基因组与MpDV-YL基因组编码策略一致,即正义链含有两个ORF(ORF1和ORF2),预测编码非结构蛋白NS1和NS2,而反义链含有两个ORF(ORF3和ORF4),预测编码结构蛋白 VP1和VP2,该结果进一步显示中国国内的桃蚜浓核病毒与桃蚜浓核病毒荷兰株系的编码策略不同;  2、采用定量PCR检测MpDV-YL在桃蚜幼虫的头部、肠道、胚胎及表皮组织中的复制。结果表明,桃蚜浓核病毒在蚜虫肠道内的拷贝数极显著高于在其它组织中,揭示该病毒主要在蚜虫的肠道内复制;  3、采用定量PCR检测MpDV-YL 预测的NS1、NS2、VP1、VP2编码基因在蚜虫体内及幼蚜头部、肠道、胚胎及表皮组织中的转录水平。结果表明,VP1编码基因在蚜虫体内的转录水平极显著高于其它基因的表达水平;同时,各基因均在蚜虫肠道内存在较高的转录水平;  4、为了检测桃蚜浓核病毒能否在桃蚜寄主植物体内转运,我们检测了感染MpDV-YL桃蚜取食寄主(辣椒和甘蓝)后这两种植物叶片、茎、根中MpDV-YL的复制情况。定量PCR结果显示,MpDV-YL在两种植物叶片中的基因组拷贝数显著高于其它组织;进一步分析表明,经DNase I处理后,两种植物叶片中MpDV-YL含量极显著降低,推测在桃蚜寄主植物叶片中存在的MpDV-YL可能来源于叶片表面蚜虫蜜露的污染;  5、构建了的MpDV-YL VP1和VP2基因的瞬时表达质粒并转染草地贪夜蛾Sf9细胞。双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)检测结果表明VP1与VP2之间可能不存在相互作用;随后,构建了6×His融合的VP1和VP2瞬时表达质粒并转染Sf9细胞。Western blot检测结果表明,VP1和VP2在Sf9细胞中都表达了预期大小的蛋白,推测这两个蛋白未发生剪切。  综上所述,国内存在的桃蚜浓核病毒基因组编码策略可能与已发现的桃蚜浓核病毒荷兰株系存在较大差异,而该类病毒在无脊柱动物细小病毒的进化中可能单独作为一个分支。桃蚜浓核病毒主要在蚜虫肠道内复制,该类病毒可能不能通过蚜虫取食而进入桃蚜植物组织并发生转运。上述结果为进一步研究桃蚜浓核病毒侵染机理奠定了一定基础。
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