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现有荔枝品种成熟期过于集中导致的季节性过剩已经成为严重制约荔枝产业发展的瓶颈问题,特早熟作为缓解季节性过剩的目标性状的重要性日益突显,但现有特早熟荔枝种质资源大多品质差、无栽培价值。因此发掘荔枝特早熟性状相关候选基因及分子标记,对于实现荔枝特早熟性状的分子标记辅助选择具有重要意义。 在前期的研究中,本实验室获得了一个与荔枝特早熟性状密切相关的SNP51位点(碱基置换类型为C/T),本研究拟进一步探讨该SNP位点所在的黄酮醇合酶基因(Flavonol synthase,FLS)与荔枝特早熟性状的相关性,及其在不同成熟期性状荔枝品种间的差异规律。主要结果如下: 1.荔枝黄酮醇合酶(LcFLS)基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)全长1008bp,编码335个氨基酸,分子量大小为38.88KDa,是稳定性的水溶性蛋白。预测LcFLS蛋白亚细胞定位于细胞质中,其三维结构主要是由随机卷曲(random coil,37.61%),α-螺旋(apha helix,32.74%),延伸链(extrend strand,22.39%)及β-转角(β-turn,7.76%)组成。同源性比对及系统进化分析表明,LcFLS氨基酸序列与柑橘的相似度最高,达到78%,与柑橘的亲缘关系最近,遗传距离为0.242。 2.在SNP51位点上表现为CC纯合基因型的特早熟品种,其LcFLS基因的长度均为2199bp,且序列完全一致;在SNP51位点上表现为TT纯合基因型的中晚熟品种,其LcFLS基因的长度为2202-2222bp不等;在SNP51位点上表现为CT杂合基因型的早熟品种则同时具有特早熟品种的2199bp和中晚熟品种中的2205bp序列。因此利用LcFLS基因的序列特征及其序列上的SNP51位点可以准确区分特早熟品种与其他品种,可应用于荔枝特早熟性状的早期预选。此外,云南野生荔枝的LcFLS基因序列与特早熟品种完全一致,海南野生荔枝的LcFLS基因序列与中晚熟品种基本一致,与荔枝品种的独立驯化式样完全一致,表明LcFLS基因在不同成熟期品种的野生荔枝之间已具有明显差异。 3.构建了pET-28aa(+)-LcFLS原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,纯化获得了LcFLS蛋白。克隆获得LcFLS基因的启动子序列(1403bp),元件分析发现其具有三个MYB结合位点TATCC、GATTTAC和AACCTAA(MRE结构域),表明LcFLS启动子可能受到MYB转录因子的调控。 4.LcFLS相对表达量在整个果实发育时期,在特早熟品种(三月红)中的相对表达量始终最高,晚熟品种(糯米糍和怀枝)最低,早熟(水东)和中熟品种(黑叶)的表达量居中,表现出由特早熟荔枝至晚熟荔枝逐渐降低的趋势,表明LcFLS的表达量与荔枝成熟期差异有一定的相关性。 5.筛选出5个与拟南芥中调控FLS基因的R2R3-MYB7亚家族(subgroup7,SG7)聚在一起的荔枝R2R3-MYB成员,对上述5个候选基因在不同成熟期荔枝品种花后15天小果和花后30天果皮中的表达量进行分析,结果发现Litchi Glean10052059和Litchi Glean10061187在上述两个组织中的表达量分别表现出从特早熟荔枝至晚熟荔枝逐渐减低和升高的趋势,与LcFLS基因的表达趋势一致或相反。其中仅Licthi Glean10061187基因具有拟南芥SG7家族成员的SG7 motif结构域,因此初步推测Licthi Glean10061187基因很可能是调控LcFLS的R2R3-MYB转录因子。