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肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是在类风湿性关节炎（RA）等疾病的病理变化中起关键作用的细胞因子，临床试验结果证实，TNF-α是治疗该类疾病的合适靶点。针对TNF-α的抑制剂用于治疗RA取得了良好的效果，其代表药物有Enbrel，Remicade，Humira等。随着TNF抗体类药物临床试验的开展，不断有新的适应症出现，其市场空间不断扩大。这些药物具有特异性高，靶向性好，副作用低的优点，已逐渐成为与氨甲碟呤一起治疗RA的一线用药。但是它们也存在着不同的缺陷，主要有如下两点：第一，Remicade是人鼠嵌合抗体，含有25%的鼠源片段，长期注射可能会引起人抗鼠抗体（HAMA）反应；第二，这些抗体所携带的Fc段具有激活补体和ADCC等活性，会导致表达TNF的细胞凋亡，产生一系列副作用。因此研发全人源小分子TNF-α抗体具有特别重要的意义。本课题中全人源小分子TNF-α抗体的研发包括三个部分：TNF-α抗原的表达纯化，抗体库筛选和抗TNF-α Fab’抗体的表达纯化。TNF-α抗原的表达纯化：根据GenBank中的人源TNF-α序列，全化学合成TNF-α基因，提取基因构建TNF-α表达载体pET-23b/TNF-α并将其转化大肠杆菌BL21（DE3），获得阳性克隆。将阳性克隆于37℃诱导表达16h得到发酵液上清中可溶性分泌表达的TNF-α，将其浓缩后再通过层析纯化，最终得到了TNF-α纯品，纯度大于95%，比活性为4.4×106U/mg，产量为4mg/L。抗体库筛选：我们利用TNF-α作为抗原对噬菌体抗体库进行筛选，以期获得对TNF-α有特异性亲和力的抗体克隆。经过六轮固相淘洗，与TNF-α特异性结合的噬菌体抗体克隆从1.1×103pfu上升至2×105pfu，产出投入比从3.2×10-8上升至1.2×10-6，尽管随着筛选轮数的增加洗脱条件不断严格，最终还是得到了200倍的富集。从第六轮淘洗获得的克隆中随机挑选200个克隆进行ELISA筛选，得到5株阳性克隆。进一步对这5株克隆进行抗原结合特异性比较，最终确定了一株与TNF-α特异性最好的克隆G11。抗TNF-α Fab’抗体的表达纯化：将筛选得到的G11克隆进行测序，获得抗体基因序列，构建Fab’抗体表达载体。将载体转化大肠杆菌BL21（DE3），获得阳性克隆后，我们对其表达条件进行优化，比较了培养基和诱导时间对表达量的影响，结果显示，用LB培养基在30℃，IPTG诱导浓度0.1mM下，诱导24h，Fab’抗体表达量最高。我们还对细菌破壁方法进行了比较，在超声，渗透压休克、溶菌酶和反复冻融中我们选择反复冻融法破碎细胞。纯化后的Fab’抗体用SDS-PAGE电泳检测，结果显示抗体蛋白条带单一，非竞争性ELISA测定抗体与TNF-α的亲和常数为Ka=4×10-13M-1。另外体外中和试验显示，Fab’抗体可以在一定程度上中和TNF-α对L929细胞的杀伤作用，在浓度为3.2ng/ml时对TNF-α细胞毒的中和率达到85%，在800pg/ml时对TNF-α细胞毒的中和率达到48%。本研究以原核表达的TNF-α为抗原，从噬菌体抗体库中筛选TNF-α抗体并对其进行Fab’形式改造，最终获得具有一定生物学活性的TNF-α人源性中和Fab’抗体，为相关疾病的治疗奠定良好的基础。