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研究背景:甲基苯丙胺（METH）是苯丙胺类的中枢精神兴奋剂,其色白,状如冰,俗称“冰毒”,是目前危害最严重和最广泛的毒品之一。METH诱导的神经毒性、成瘾性和依赖性是全球共同面临的重大公共卫生课题和研究热点之一。METH具有多种药理学、毒理学特性,长期滥用可引起神经生物学、病理学和行为学的改变。近年来研究显示,METH有较强的神经毒性,可引起神经结构和功能损伤性改变,诱发大脑发生与阿尔茨海默病和帕金森病等神经系统退行性疾病类似的病理学改变。目前的研究提示METH的神经毒性机制主要包括:氧化应激损伤、体温平衡失调、兴奋性神经毒性及炎性反应等。但现有研究结果尚不能阐明METH具体的神经毒性作用机制,对其毒性作用、成瘾性、依赖性缺乏有效的治疗和干预手段。本研究以METH破坏神经元胞内离子稳态这一现象为切入点,结合体内和体外实验,较深入探讨了METH引起神经细胞的毒性作用及机制,以期为METH的神经毒性机制研究提供新的理论基础,进而为METH引起的神经毒性提供干预手段。研究目的:建立动物METH亚急性染毒模型和原代培养皮层神经元METH染毒模型,运用行为学、生物学、分子学、膜片钳等技术与方法系统地观察METH对动物行为、神经元胞内离子稳态的影响,利用特异性抑制剂和慢病毒转染等方法,探讨METH诱导离子稳态失调与神经元退行性病变和细胞凋亡之间的关系。研究方法:体内实验:C57BL/6J雄性小鼠随机分Control、Saline、METH三组,每组10只。每日2次（8:00,20:00）,连续7天,腹腔注射METH 10mg/kg,制成亚急性染毒动物模型。检测每次给药前后小鼠体重、体温变化,并用Dodd和Hoffman方法对小鼠刻板行为进行评分。最后一次注射METH后12小时进行Y-迷宫实验,检测小鼠学习记忆功能。小鼠处死后,取大脑组织,高尔基染色观察小鼠大脑神经元树突变化,NOS活性试剂盒检测NOS活性改变。体外实验:CCK-8细胞计数试剂盒检测不同浓度METH作用不同时间后的神经元活力。彗星实验和Hoechst染色观察神经元DNA和细胞核。线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）检测线粒体膜电位变化。Western blot技术检测细胞凋亡蛋白Cyt-c、Bax、Bcl-2、Caspase3,神经退行性病理性蛋白APP、Tau,MAPK信号通路,钙相关蛋白CaM、CaMKII,钾相关蛋白Kv4.2、KChIPs的表达。利用Fluo4-AM探针检测胞内钙离子浓度,通过全细胞膜片钳检测钾电流。特异性抑制剂PD98059、SP600125、SB203580、硝苯地平、KN62、KN93、W7分别抑制ERK、JNK、p38、L型钙通道、CaMKII、CaM的表达或活性。构建Kv4.2质粒慢病毒转染神经元后,观察METH对神经元损伤情况。研究结果:1.METH对小鼠行为学影响亚急性METH染毒动物模型中,METH组小鼠注射METH约5分钟后开始出现刻板行为,异常活动持续2小时以上。注射METH 30分钟后,小鼠体温增加,3小时候恢复正常。之后小鼠表现为蜷缩,活动减少。METH组小鼠的体重和脏器系数无明显变化,但刻板行为增加,活动量减少。2.METH对小鼠大脑神经元的损伤作用结果显示METH引起小鼠皮层神经元树突长度变短,树突棘密度显著减小,大脑TNOS和iNOS的活性增加。脑组织中的Bax、Cleaved-caspase3、APP、Tau蛋白表达增加。3.METH对原代大脑皮层神经元的影响30μMMETH处理24小时开始对神经元具有损伤作用。METH对神经元活力的损伤呈浓度依赖性和时间依赖性。彗星实验和Hoechst染色发现METH可引起神经元细胞核浓聚、DNA片段化。300μM METH诱发神经元线粒体膜电位下降,Cyt-c释放,Bax、Cleaved-caspase3、APP、Tau蛋白高表达,Bcl-2低表达。4.MAPK信号通路参与METH诱导的神经元凋亡300μM METH对MAPK信号通路ERK、JNK、p38有不同程度的激活。p38特异性抑制剂SB203580下调METH诱导的Caspase3激活。5.METH介导胞内钙稳态失衡引起神经元凋亡METH通过L型钙通道引起胞外Ca2+内流,并激活Ca2+下游蛋白CaM、CaMKII。使用L型钙通道的抑制剂硝苯地平可减轻METH诱导的DNA断裂、细胞核浓聚、并抑制Caspase3水解,抑制APP、Tau的高表达。CaM、CaMKII参与METH介导的凋亡。CaMKII抑制剂KN62、KN93和CaM抑制剂W7下调METH诱导的Caspase3水解。6.METH介导胞内钾离子外流引起神经元凋亡METH可引起神经元钾离子的大量外流,上调瞬时外向钾通道的亚型Kv4.2胞浆向胞膜的转运,并促进钾通道相关蛋白家族KChIPs的表达。METH对Kv4.2和KChIPs的上调受CaM、CaMKII的调控。CaMKII抑制剂KN62、KN93和CaM抑制剂W7下调METH诱导的Kv4.2和KChIPs高表达。慢病毒转染神经元,使Kv4.2的过表达后可促进METH的神经毒性作用。研究结论:1.METH对小鼠具有神经毒性,可引起小鼠行为学、神经突触可塑性、神经退行性变化。2.METH对神经元的凋亡影响主要依赖线粒体通路。3.低浓度的METH长时间作用可诱导神经元内APP和Tau蛋白高表达,Tau呈超磷酸化。4.MAPK信号通路参与METH诱导的神经元凋亡。5.L型钙通道参与METH诱导的外钙内流,引起细胞内钙离子浓度升高,激活下游钙信号通路。6.钙相关蛋白CaM、CaMKII的激活参与METH诱导的神经元凋亡和退行性改变。7.Kv4.2及其钾相关蛋白KChIPs的表达受Ca2+、CaM、CaMKII调控。8.Kv4.2介导的钾离子外流参与METH诱导神经元凋亡的过程。