基于磁珠固相载体的时间分辨荧光免疫分析技术平台的建立及临床应用

来源 :南方医科大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:suli115296303
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标记免疫分析,顾名思义,就是将标记技术和免疫分析技术相结合进行生化物质的分析测定。标记免疫分析技术的核心在于结合标记示踪技术的高敏感性和医学免疫学抗原抗体反应的高特异性。标记免疫分析作为一大类超灵敏、高特异性检测技术的总称,因其具有众多独特优点,已广泛应用于食品环境痕量物质的检测、基础医学研究、临床疾病的治疗及监测等领域。现代标记免疫分析技术最早始于1959年由美国学者Berson和Yallow等人首次以放射性同位素为标记物并成功应用于血浆胰岛素测定的放射免疫分析技术。自60年代开始得益于放射免疫分析技术的发展和完善,免疫学指标的检测灵敏度得到了极大提高。这种传统的分析方法特异性强,灵敏度高,但是由于标记的放射性同位素存在衰减周期和对生物及实验室环境的潜在危害等因素,大大限制了该试剂的使用寿命,使得该技术的发展受到了一定程度的制约。到了70年代,瑞典科学家首先采用酶取代同位素建立了酶标记免疫分析技术,酶标记物避免了对环境污染和人身危害,同时试剂有效期较长,使得标记免疫分析在非放射性标记免疫分析技术的道路上得到了长足的发展。至今为止,随着标记物的不断拓展和标记技术的进步,又研发出以胶体金为标记物的胶体金免疫分析技术,以荧光素为标记物的荧光免疫分析技术,以酶学、化学发光底物为基础的化学发光免疫分析技术、以电化学为基础的电化学发光免疫分析技术和以镧系稀土元素为标记物的时间分辨荧光免疫分析技术等等。它们检测的反应模式基本相同,依据标记物的不同而采用的测量模式及所收集的信号有所差别。标记免疫分析技术的发展革新离不开新标记物的不断发现,同时得益于单克隆抗体和基因工程抗体技术的应用,极大地促进了免疫放大技术的发展,显著提高了免疫检测的敏感性和特异性。正是有赖于新技术和新方法不断涌现,标记免疫分析至今已成为一类检测微量和超微量生物活性物质和外环境无机物的生物化学免疫分析技术,广泛应用于食品安全和环境卫生领域的细菌、病毒、真菌、毒素、寄生虫、药物及农药残留的检测,更是在临床医学诊断领域的肿瘤标记物、传染病、糖尿病、激素、产前筛查、药物及药物代谢物的辅助诊断和治疗过程的监测发挥着不可替代的作用。时间分辨荧光免疫分析技术(Time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)是20世纪80年代初发展起来的最具发展前途的非放射免疫分析技术,是继放射免疫分析之后标记物发展的一个新的里程碑,已成为生物医学研究和临床超微量生化检验中最有发展前景的分析手段。TRFIA采用三价稀土离子铕(Eu3+)、钐(Sm3+)、铽(Tb3+)和镝 (Dy3+)及其鳌合剂作为示踪物,替代传统的酶、同位素、荧光素、化学发光和生物发光等物质来标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞,待反应体系包括抗原抗体免疫反应、生物素亲和素的亲和反应、核酸探针杂交反应等发生后,利用时间分辨荧光测量法和光谱分离技术排除样品中非特异性干扰,测定最后产物中的荧光强度,从而有效地提高了检测的灵敏度,它的检测限可超过10-8mol。TRFIA以稀土元素作为标记物,具有激发光谱带宽、发射光谱带窄、Stokes位移大、荧光衰变时间长、荧光强度高、标记物制备简便及理化性质稳定、储存时间长、无放射性污染、不受样品自然荧光干扰和可重复激发测量等优越性,并可实现多标记对同一样品的多个待测物的同时检测和自动化,因而倍受生物医学工作者的青睐。我国是稀土元素大国,对TRFIA开展深入研究和大力推广其科研成果的产业化发展,有利于提高我国生物医学检测技术的发展和竞争力。至今为止微孔板仍是国内外免疫分析技术中免疫分析发生反应和信号检测的主要载体。抗原、抗体和其它生化物质通过多种机制吸附至载体表面,包括依靠疏水键、流水/离子键的被动吸附和引入其它活性基团如氨基和碳基的共价结合,以及通过表面改性后的亲水键结合。随着临床诊断对免疫分析技术要求的不断提高,以聚苯乙烯板为固相载体的缺点日益显著:(1)抗原抗体通过物理吸附包被在微孔板上,结合效率低且浪费原料;(2)微孔板表面积一定,抗原抗体包被量有限,从而限制检测灵敏度和检测上限;(3)微孔板内固液相反应接触面积小,反应时间长;(4)对于整条的微孔板,临床样品检测不能随到随做,须积累到一定的样本量后统一测量。磁性纳米颗粒是纳米粒子的一种,是20世纪50年代研制出的一种新型功能材料。磁性纳米颗粒在外加磁场的作用下,能够快速地与底液相分离,具有操作简便、分离效率高、较大的比表面积及良好的物理稳定性等优点,是一种性能优良的磁性分离载体。目前,将磁性纳米颗粒高效的分离和富集作用与免疫学反应的高度特异性相结合,成为了近年来发展迅速的一项新的免疫学技术——免疫磁珠,在细胞分选、免疫检测和疾病诊断、癌症治疗、食品及环境中微生物检测等领域得到越来越广泛的应用。磁珠表面通过外部修饰的功能基团,可结合活性蛋白质而作为抗原抗体反应的载体。当偶联在磁珠上的抗体与特异性抗原物质结合后,则形成“磁珠-抗体-抗原免疫复合物”,该复合物具有强磁响应性,在磁力的作用下定向移动,使复合物与液体中其他物质分离,而达到分离、浓缩、纯化特异性蛋白物质的目的。作为整个免疫反应和信号收集的载体,磁珠相比传统的微孔板具有显著优越性:(1)纳米磁珠比表面积大,能结合更多的蛋白分子,依据磁珠用量可大大提高检测范围;(2)通过磁珠表面的化学基团与蛋白形成共价偶联,相对以聚苯乙烯为材料的微孔板的物理吸附作用更牢固,稳定性更高,同时节省试剂原料;(3)免疫磁珠均匀悬浮于反应溶液中,大大增加与样本中的待测物反应接触面积,可减少反应所需的样本量,同时能更快达到反应动态平衡,从而加快反应速度和节省反应时间;(4)将连有多种捕获蛋白的磁珠与镧系元素示踪物的多标记技术联合应用,实现同一样本中多个待测物的同时检测,并且易实现全自动个体化检测,实验样本随到随做。近年来在免疫检测行业内开发出的磁珠与传统的酶联免疫分析及化学发光免疫分析相结合形成的磁珠酶联免疫分析技术、磁珠化学发光免疫分析技术,该技术已广泛开展并应用至临床疾病检测。据文献报道和市场调研,目前市面上基于时间分辨荧光免疫分析技术的试剂依旧基于传统的微孔板式免疫分析,并且在结合免疫磁珠和时间分辨荧光免疫分析技术应用于临床疾病标志物分子检测方面缺少全面而准确的系统性研究。鉴于此,本研究对基于磁珠新型载体的免疫分析平台进行全面而准确的临床应用评估。对血清中不同类型的蛋白分子(包括大分子抗原抗体、半抗原及小分子单价抗原)而采用不同的反应模式进行研究,根据待测物的性状及检测的具体条件而设计不同的检测模式,包括双抗体夹心法、双抗原夹心法、竞争法等。本实验采用乙型肝炎病毒表面抗原(Hepatitis B surface antigen, HBsAg)及e抗原(Hepatitis Be antigen, HBeAg)、乙型肝炎病毒表面抗体(Antibody to hepatitis B surface antigen, anti-HBs)、游离甲状腺素(Free Thyroxine, FT4)三种在方法学上具有代表性的血清标志物,分别对双抗体夹心法、双抗原夹心法以及竞争法三种不同的反应模式进行可行性分析。本课题实验内容主要分为三大部分:(1)采用双抗体夹心反应模式,研制HBsAg和HBeAg磁珠时间分辨荧光免疫分析试剂;(2)采用双抗原夹心反应模式,研制抗-HBs磁珠时间分辨荧光免疫分析试剂;(3)采用直接竞争反应模式,研制FT4磁珠时间分辨荧光免疫分析试剂。实验设计上涵盖:(1)摸索不同粒径、不同化学基团修饰的磁珠连接蛋白,选取合适的磁珠作为固相载体并且优化连接工艺和镧系稀土元素螯合物标记蛋白;(2)反应体系的建立和优化,并通过优化的反应体系对试剂的各项性能指标作出全面而整体的评价,包括准确度、分析灵敏度、检测范围、剂量-反应曲线、特异性、精密度、抗干扰性和稳定性分析;(3)用自制试剂与国外同类进口诊断试剂进行平行比对,评价其初步应用于临床诊断的可行性。利用磁珠作为固相载体建立的时间分辨反应体系所具有的快速、小样品量、检测范围宽、高灵敏度、小型化等特点极大满足临床随诊检测的需要,将使其具有更广阔的临床应用前景。实验一研究结果:(1)自制HBsAg磁珠时间分辨荧光免疫分析试剂在最优条件下,分析灵敏度为0.02 IU/mL,线性范围达0.2~700 IU/mL。检测国家参考品的实测浓度与期望浓度的比值在0.925~1.067之间,分析内和分析间变异系数分别在为4.7%~8.7%和3.8%~7.5%之间,符合试剂鉴定要求。将高浓度的HBeAg、 HBcAg、HCV、HIV、TP、RF阳性样品用本试剂测定,无明显交叉反应。检测质控样本时不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰。将自制HBsAg试剂与雅培公司化学发光试剂对399份血清样本进行平行比对实验,临床特异性和敏感性符合率均100%,经配对计数资料卡方检验:McNemar检验结果P=1(双侧);K系数检验结果,K=1,P=0.000,说明两种方法吻合度有统计学意义且较强。再将231份双阳性血样测定结果分别设为横坐标和纵坐标做线性相关分析,相关方程为:Y=1.182X-0.017,相关系数r=0.989,P<0.001。经上述统计学处理结果表明,两种检测方法吻合度有统计学意义,临床血样测值均具有显著相关性。(2)自制HBeAg磁珠时间分辨荧光免疫分析试剂在最优条件下,分析灵敏度为0.021PEI U/mL,线性范围达0.4-160 PEI U/mL。检测国际参考品不同稀释比例样品的实测浓度与期望浓度的比值在0.942~0.978之间,分析内和分析间变异系数分别在为2.8%~4.3%和4.2%~6.0%之间,符合试剂鉴定要求。将高浓度的HBsAg、HBcAg当作样品用本试剂测定,无明显交叉反应。检测质控样本时不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰。将自制试剂与雅培公司的化学发光试剂对257份血清样本进行平行比对实验,临床特异性和敏感性符合率均分别为95.8%和98.9%,经配对计数资料卡方检验:McNemar检验结果P=1(双侧);K系数检验结果,K=0.951,P=0.000,说明两种方法吻合度有统计学意义且较强。再将184份双阳性血样测定结果分别设为横坐标和纵坐标做线性相关分析,相关方程为:Y=1.002X-0.333,相关系数r=0.974,P<0.001。经上述统计学处理结果表明,两种检测方法吻合度有统计学意义,临床血样测值均具有显著相关性。实验二研究结果:自制抗-HBs磁珠时间分辨荧光免疫分析试剂在最优条件下,分析灵敏度为0.45 mIU/mL,线性范围达2~600 mIU/mL。检测自制参考品的实测浓度与期望浓度的比值在0.964~1.018之间,分析内和分析间变异系数分别在为2.4%~4.3%和3.5%~5.0%之间,符合试剂鉴定要求。将高浓度的HBeAb、 HBcAb当作样品用本试剂测定,无明显交叉反应。检测质控样本时不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰。将自制试剂与雅培公司的化学发光试剂对269份血清样本进行平行比对实验,临床特异性和敏感性符合率均分别为96.3%和98.1%,经配对计数资料卡方检验:McNemar检验结果P=0.687(双侧);K系数检验结果,K=0.932,P=0.000,说明两种方法吻合度有统计学意义且较强。再将210份双阳性血样测定结果分别设为横坐标和纵坐标做线性相关分析,相关方程为:Y=0.934X+2.511,相关系数r=0.988,P<0.001。经上述统计学处理结果表明,两种检测方法吻合度有统计学意义,临床血样测值均具有显著相关性。实验三研究结果:自制FT4磁珠时间分辨荧光免疫分析试剂在最优条件下,分析灵敏度为0.47 pmol/L,线性范围达2~200 pmol/L。检测自制参考品的实测浓度与期望浓度的比值在0.934~0.973之间,分析内和分析间变异系数分别在为2.7%~4.3%和4.0%~7.0%之间,符合试剂鉴定要求。将高浓度的T3、FT3、rT3当作样品用本试剂测定,无明显交叉反应。检测质控样本时不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰。自制试剂通过对240份健康查体者血清FT4进行分析,确定正常人参考值范围为11.0~25.0ng/mL。将自制试剂与雅培公司的化学发光试剂对202份血清样本进行平行比对实验,经配对卡方检验,符合率达到99.0%,血样测定结果分别设为为横坐标和纵坐标做线性相关分析,相关方程为:Y=0.986X+0.037,相关系数r=0.980,P<0.001。经上述统计学处理结果表明,两种检测方法吻合度有统计学意义,临床血样测值均具有显著相关性。综上所述,本研究利用磁珠作为固相载体结合时间分辨免疫分析技术,成功研发出基于双抗体夹心、双抗原夹心及竞争法反应模式的试剂,用于检测人血清中HBsAg、HBeAg、抗-HBs及FT4四种不同血清分析物。经评价,磁珠时间分辨荧光免疫分析试剂的各项指标(准确度、灵敏度、精密度、特异性、抗干扰性等)均满足临床检测试剂要求,与同类进口试剂比较,其临床特异性和敏感性均无显著差异,线性相关分析具有显著相关性。本文全面而准确地系统性阐述了磁珠作为固相载体能够提高检测灵敏度,扩大线性范围,缩短分析时间,提高检测效率等优点,表明了基于磁珠的时间分辨荧光免疫分析平台应用于临床疾病标志物检测的可行性,有望通过进一步优化应用于生产,开发出符合临床分子诊断和食品环境微量物质检测等需求的免疫分析试剂,对标记免疫分析技术的开拓与发展具有非常重要的意义。
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