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新孢子虫病是严重危害养牛业健康发展的重要繁殖障碍性疾病,该病可垂直传播,带虫母牛可将虫体直接传给新生犊牛,随着我国养牛业的发展和牛的频繁交易,该病在我国的流行区域逐渐扩大。目前,国内外对新孢子虫病的研究都局限在病原学、分子生物学、流行病学、诊断和免疫学方面,但对新孢子虫病的防控尚无有效的方法。因此,本研究提取牛源犬新孢子虫基因组DNA,应用PCR技术扩增牛源犬新孢子虫表面蛋白基因NcSRS2和致密颗粒蛋白基因NcGRA7,SOE-PCR技术拼接NcSRS2和NcGRA7基因,构建NcSRS2-NcGRA7复合基因重组克隆质粒、重组真核质粒、重组腺病毒穿梭质粒及重组腺病毒,制备NcSRS2-NcGRA7复合基因核酸疫苗和重组腺病毒疫苗,应用Prime-Boost免疫策略及单一疫苗分别接种BABL/c小鼠,测定体液免疫和细胞免疫应答水平,并进行攻虫试验,评价免疫保护性,以期为牛的新孢子虫病新型疫苗的研究奠定基础。1、牛源犬新孢子虫NcSRS2-NcGRA7复合基因的克隆与生物信息学分析提取牛源犬新孢子虫基因组DNA,应用PCR技术扩增犬新孢子虫表面蛋白基因NcSRS2和致密颗粒蛋白基因NcGRA7,SOE-PCR技术拼接NcSRS2和NcGRA7基因,构建NcSRS2-NcGRA7复合基因重组克隆质粒,并进行PCR鉴定、双酶切鉴定及生物信息学分析。结果,NcSRS2基因扩增片段大小为1061bp,NcGRA7基因扩增片段大小为364bp, NcSRS2-NcGRA7复合基因扩增片段大小为1482bp；获得重组克隆质粒pMD18-NcSRS2-NcGRA7经PCR鉴定、双酶切鉴定正确；测序分析表明,与GenBank中已发表的美国株犬新孢子虫(AF061249、AF176649)核苷酸序列同源性为99%；经DNAman等软件分析,预测NcSRS2-NcGRA7复合蛋白抗原指数较高,复合蛋白二级结构以α-螺旋和β-折叠为主,三级结构中两种蛋白独立折叠,并借助Linker互相连接,功能互不影响。2、NcSRS2-NcGRA7复合基因核酸疫苗的构建重组克隆质粒pMD18-NcSRS2-NcGRA7与pVAX1真核表达载体同时进行EcoRI XbaI双酶切后,构建重组真核表达质粒pVAXl-NcSRS2-NcGRA7,将PCR鉴定和酶切鉴定正确的重组真核表达质粒脂质体介导转染Vero细胞,应用RT-PCR、IFAT及Western blotting技术鉴定pVAX1-NcSRS2-NcGRA7重组质粒在Vero细胞中的表达。结果,构建重组真核表达质粒pVAX1-NcSRS2-NcGRA7经PCR鉴定和酶切鉴定正确,并能够在Vero细胞中表达。扩增、纯化重组质粒制备NcSRS2-NcGRA7复合基因核酸疫苗。3, NcSRS2-NcGRA7复合基因重组腺病毒疫苗的构建重组克隆质粒pMD18-NcSRS2-NcGRA7经EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切后,亚克隆至相同酶切回收后的腺病毒穿梭载体pCR259中,构建pCR259-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒穿梭质粒,将PCR鉴定和酶切鉴定正确的pCR259-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒穿梭质粒依次转化HighQ-1Transpose-AdTM294和HighQ-1TM感受态细胞,进行同源重组与纯化,构建NcSRS2-NcGRA7复合基因重组腺病毒表达质粒,PacⅠ酶切线性化后,脂质体转染QBI-HEK293细胞包装Ad5-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒。结果,经PCR检测,构建的重组腺病毒含有NcSRS2-NcGRA7复合基因；经IFAT和Western blotting检测,NcSRS2-NcGRA7复合基因在QBI-HEK293细胞中获得表达。测得Ad5-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒滴度为109TCID50/mL。4、NcSRS2-NcGRA7复合基因疫苗的Prime-Boost免疫策略研究80只BALB/c小鼠随机分为4组,每组20只,分别为Prime-Boost免疫策略组(核酸疫苗初免,重组腺病毒疫苗二免、三免)、Ad5-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒疫苗组、pVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗组及PBS对照组。每隔2W肌肉注射接种一次,共接种3次,每次免疫前及三免后2W、4W、6W分别断尾采血(三免2W后攻虫小鼠除外),分离血清。ELISA测定IgG、IgG1、IgG2a抗体水平；流式细胞术检测三免2W后每组5只BALB/c小鼠的CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群变化；ELISA试剂盒检测细胞因子IFN-γ、IL-4、TNF-α水平,以及血清中N0浓度。结果：抗体水平：三免后,IgG OD410,值Prime-Boost免疫策略组显著高于Ad5-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒疫苗组(p<0.05)、pVAXl-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗组(p<0.01)及PBS对照组(p<0.01)；IgG1浓度Prime-Boost免疫策略组与Ad5-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒疫苗组比较,差异不显著(p>0.05),而与pVAXl-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗组及PBS对照组比较,差异显著(p<0.05)；IgG2a浓度Prime-Boost免疫策略组显著高于Ad5-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒疫苗组(p<0.05)、pVAXl-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗组(p<0.01)及PBS对照组(p<0.01)。T淋巴细胞亚群变化：三免2W后,CD4+T细胞数量Prime-Boost免疫策略组与Ad5-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒疫苗组、pVAXl-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗组比较,差异显著(p<0.05),而与PBS对照组比较,差异极显著(p<0.01)；CD8+T细胞数量Prime-Boost免疫策略组与Ad5-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒疫苗组、pVAXl-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗组比较,差异不显著(P>50.05),与PBS对照组比较,差异显著(p<0.05)；CD4+/CD8+比值Prime-Boost免疫策略组与Ad5-NcSRS2-.NcGRA7重组腺病毒疫苗组比较,差异显著(p<0.05),而与pVAXl-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗组及PBS对照组比较,差异极显著(p<0.01)。细胞因子水平：三免后,IFN-γ浓度Prime-Boost免疫策略组显著高于Ad5-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒疫苗组(p<0.05)、pVAXl-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗组(p<0.01)及PBS对照组(p<0.01)；IL-4浓度Prime-Boost免疫策略组显著高于Ad5-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒疫苗组(p<0.05)、pVAXl-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗组(p<0.05)及PBS对照组(p<0.01)；TNF-α浓度Prime-Boost免疫策略组与Ad5-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒疫苗组比较,差异不显著(p>0.05),而与pVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗组及PBS对照组比较,差异显著(p<0.05)。血清中NO浓度：三免后,N0浓度Prime-Boost免疫策略组略高于Ad5-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒疫苗组,差异不显著(p>0.05),与PVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗组比较,差异显著(p<0.05),与PBS对照组比较,差异极显著(p<0.01)。5、NcSRS2-NcGRA7复合基因疫苗的免疫保护性评价三免2W后,每个试验组各取10只BABL/c小鼠,每只腹腔攻击犬新孢子虫速殖子106个,攻虫后观察小鼠的临床症状并统计存活率；攻虫4W后,脱颈处死存活的BABL/c小鼠,病理解剖学观察各主要脏器的外观变化,病理组织学H.E染色和免疫组织化学观察脑组织、肝、脾等脏器的病理组织学变化及虫体定位,PCR方法检测脑组织、肝、脾等脏器中犬新孢子虫Nc-5基因。结果,攻虫4W后的BALB/c小鼠,Prime-Boost免疫策略组和Ad5-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒疫苗组的存活率均为100%,未出现明显临床症状,主要器官组织均无明显病理变化和虫体存在,PCR检测各器官组织中犬新孢子虫Nc-5基因均为阴性；pVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗组的存活率为60%,攻虫后第7d出现精神沉郁、后肢麻痹等临床症状,主要器官组织以泛发型充血、出血为特征,脑、肝、脾组织中发现犬新孢子虫包囊或速殖子,PCR检测心、肝、脾、肺及脑组织中犬新孢子虫Nc-5基因阳性；而PBS对照组的存活率为20%,攻虫后第3d出现耸毛、怠惰、四肢瘫痪等临床症状,各器官组织以泛发型充血、出血为特征,脑、肝、脾组织中发现犬新孢子虫速殖子,PCR检测心、肝、脾、肺、肾及脑组织中犬新孢子虫Nc-5基因阳性。综合各试验组BALB/c小鼠免疫后产生的抗体、细胞因子等水平以及攻虫后的整体变化评价,四个试验组中Prime-Boost免疫策略组优势显著,该策略适用于新孢子虫病的防控。结论：1、应用SOE-PCR技术成功拼接了NcSRS2和NcGRA7基因,拼接复合基因的大小为1482bp,并对NcSRS2-NcGRA7复合基因进行了克隆和生物信息学分析。2、构建了重组真核表达质粒pVAX1-NcSRS2-NcGRA7,该质粒能够转染Vero细胞获得表达,并制备了pVAX1-NcSRS2-NcGRA7核酸疫苗。3、成功构建了滴度为109TCID50/mL的Ad5-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒,并制备了Ad5-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒疫苗。4、建立的Prime-Boost免疫策略与单疫苗比较,能够显著提高BALB/c小鼠的体液免疫水平和细胞免疫水平5、Prime-Boost免疫策略和Ad5-NcSRS2-NcGRA7重组腺病毒疫苗对攻虫4W后的BALB/c小鼠均有100%的免疫保护率。6、综合攻虫前后BALB/c小鼠的整体变化评价,Prime-Boost免疫策略组显著优于其他各组,该策略有助于新孢子虫病的防控。